Name: utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health gir 5T32AI7493-20 og 5R01AI089337-03. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

The University of Alabama i Birmingham Institutional Animal bruk og vedlikehold Komiteen godkjente bruken av mus som beskrevet her under godkjent protokoll nummer 101.109.272. 1. Genetisk Bygging av en modifisert Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 med Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi <ol><li> Byggingen av shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-Hans 6 / pH5S <ol><li> Bestill et plasmid som inneholder det syntetiserte DNA sekvensen HVR1-KWAS mellom restriksjonsen...

<ol>
	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

Anvendelsen av den tradisjonelle transgenet strategien på Ad5 modifikasjon for utvikling av vaksiner er blitt redusert hovedsakelig på grunn av flaskehalsen forbundet med den Ad5 PEI 4,6. Denne flaskehalsen kan delvis redusert ved bruk av alternative Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi (figur 1A), siden denne strategien kan unndra nøytralisering av Ad5 Nabs ved å erstatte nøytraliserende epitoper av Ad5 med antigener-of-interesse, og legge til rette for generering av robust immun...

Menneskelige adenovirus (Ad) er en mellomstor, ikke-kappekledde virus med en icosahedral nucleocapsid inneholder en dobbelt DNA-genom. Ad tilhører adenovirus familie, med en inndeling i sju grupper (A til G). Hver gruppe inneholder virus av forskjellige serotyper. Herav, adenovirus serotype 5 (Ad5) fra gruppe C har vært den mest grundig studert og mest brukt for vectored tilnærminger som genterapi og vaksinasjoner. Den tradisjonelle transgenet strategien har blitt utviklet og søkt om Ad5 modifikasjoner, som er preget av forskyvning av virus tidlige gener med et gen-of-interesse, og fokusert uttrykk av genet-of-interesse i en vert. Eksempler er konstruksjonen av pENV9 / Ad5hrΔE3 ved å erstatte tidlige gen 3 (E3) med rev gen av Simian Immunodeficiency Virus 1, bygging av AdCMVGag ved å erstatte en tidlig gen (E1) med gag-genet av humant immunsviktVirus (HIV) 2, og konstruksjonen av Ad-lacZ ved å erstatte E1 med lacZ-genet tre. Den brede anvendelsen av den tradisjonelle transgenet strategi på Ad5 avhenger av følgende fordeler: det brede spekter av verter for Ad5, mulighets genet ingeniør på virus og virus forplantning, den store innkvartering av utenlandske geninnskudd og sikkerhet Ad5 4,5. Imidlertid har de reduserte efficacies av Ad5-radar kliniske behandlinger ved bruk av denne strategien vært en stor flaskehals, som er kartlagt til å være primært knyttet Ad5 PEI, siden Ad5 er så utbredt blant de fleste barn og voksne 4,6. For å overvinne den store flaskehalsen Ad5, er det primære målet å utvikle en alternativ strategi omgå Ad5 PEI. Medfødt immunitet 7, adaptiv immunitet slik som nøytraliserende antistoffer (Nabs) 8-10 og CD8 + T-celleresponser mot Ad5 10 har vist seg å contribute å Ad5 PEI, med Ad5 Nabs vises til å spille den dominerende rolle i bidragene til Ad5 PEI 10,11. Videre Nabs Ad5 target epitoper lokalisert i kapsidproteiner, herunder hovedprotein hekson, fiber og Penton basen. Herav er hekson den store målet for Ad5 Nabs 8,11-13. Basert på disse funnene, har en innovativ Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi er innført. Denne romanen strategi streker erstatning eller inkorporering av proteiner-of-interesse på Ad5 kapsidproteiner, som skifter eller masker Ad5 nøytraliserende epitoper, som fører til redusert anerkjennelse av Nabs og effektive Ad5 vektor administrasjoner. Det er bemerkelsesverdig at denne strategien er konkurransedyktig fordi det kan også hjelpe vertene framprovosere robust humoral immunitet og potent cellulær immunitet ved direkte å presentere antigener-of-interesse for immunforsvaret 4,14,15. Basert på denne strategien, kan molekylær kloning og rekombinant Ad virusvektoren rednings være strukturelt deltinn i fire hovedtrinn: (a) fremstilling av gen-fragmentet av interesse ved enten polymerase kjedereaksjon (PCR) eller syntese; (B) ligering av gen-fragment inn i en shuttle plasmid som inneholder genet interesse fragment og homologe armer til et adenovirus ryggraden; (C) den homologe rekombinasjon ved ko-transformere en shuttle-plasmidet som inneholder genet interesse fragment med det lineariserte plasmid ryggrad pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) transfeksjon av lineariseres rekombinant adenovirus plasmid å redde rekombinant Ad vektor innarbeidet med antigener-of-interesse. Vår gruppe og noen andre har utvidet dette alternativet Ad innlemmelse strategi for Ad vectored vaksineutvikling mot ulike smittsomme patogener. Vi rapportert dannelse av en rekombinant vektor Ad Ad-HVR1-LGS-His 6 -V3 ved inkorporering av en His-merket HIV-1 antigen V3 inn i HVR1 nasjonale av Ad5 hekson (hexon5). Dette genererte vektor utløst strong humoral immunrespons spesifikk for epitopen 4 V3. Vi har også rapportert utvikling av Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 ved å inkludere HIV-1 membran proksimale ectodomain region (MPER) i HVR2 locale av hexon5 to. I tillegg har Dr. Zhou gruppe brukt fordelene med denne annonsen innlemmelse strategi for å utvikle Ad serotype 3 (AD3) radar vaksiner, altså., Generering av viral vektor R1SP70A3 ved å innlemme en nøytraliserende epitop SP70 av Enterovirus 71 inn i HVR1 av AD3 hekson (hexon3). R1SP70A3 generert sterke Nabs og IFN-γ produksjonen spesifikke for epitope SP70, noe som fører til høy grad av beskyttelse mot Enterovirus 71 utfordring 15. For hensikten med teknisk referanse, vår studie tok fordel av den kvalitative Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi om å fokusere på generering av en toverdig Ad5 vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ved å inkludere en HIV-1 antigen i HVR1 enda Hans tag inn HVR5 av hexon5. Den genererte viral vektor ble også immunologisk evaluert. Den Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi kan brukes til utvikling av Ad5-radarvaksinasjons tilnærminger mot ulike smittsomme sykdommer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) har blitt grundig modifisert med tradisjonelle transgene metoder for vaksineutvikling. De reduserte efficacies av disse tradisjonelt modifiserte Ad5 vektorer i kliniske studier kan være primært korrelert med Ad5 pre-eksisterende immunitet (PEI) blant majoriteten av befolkningen. Å fremme Ad5-vectored vaksineutvikling ved å løse bekymring for Ad5 PEI, har den nyskapende Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi vært ansatt. Ved fortjeneste av denne strategien, Ad5-vectored vi først konstruerte hekson shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-Hans 6 / pH5S av subkloning den hypervariable region (HVR) 1 av hekson i et tidligere konstruert shuttle plasmid HVR5-Hans 6 / pH5S, som hadde Hans 6 tag innlemmet i HVR5. Dette HVR1 DNA fragment som inneholder en HIV epitope ELDKWAS ble syntetisert. HVR1-KWAS-HVR5-Hans 6 / pH5S var da linearisert og co-transformert med linearized ryggrad plasmid pAd5 / ΔH5 (GL),for homolog rekombinasjon. Dette saman plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ble transfektert inn i cellene til å generere virusvektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Denne vektor ble validert for å ha kvalitativt trim indikert ved viral titer fysisk (VP / ml), infeksiøs titer (IP / ml) og tilsvarende VP / IP-forhold. Både HIV epitope og hans 6 tag var overflate eksponert på Ad5 capsid, og beholdt epitope spesifikke antigenevne av sine egne. En nøytralisering analyse indikerte muligheten for denne toverdig vektoren å omgå nøytralisering av Ad5-positive sera in vitro. Mus immunisering demonstrerte generasjon av robust humoral immunitet spesifikke for HIV epitope og hans seks. Dette proof-of-prinsippet studie antydet at protokollen i forbindelse med antigenet kapsid-inkorporering strategi kan være praktisk mulig anvendes for generering av Ad5-radarledet vaksiner ved å modifisere forskjellige kapsidproteiner. Denne protokollen kan til og med være further modifisert for generering av sjeldne adenovirus serotype-radarledet vaksiner.

Antigen kapsid-inkorporering strategi (figur 1A) ble benyttet for å generere det toverdige Ad5 virusvektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. For det første shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S ble konstruert ved subkloning HVR1-KWAS fragment i forrige konstruert shuttle plasmid HVR5-His 6 / pH5S 17. Dernest plasmidet pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14 ble bygget av en homolog rekombinasjon mellom fragment av &quot;EcoRI-HVR1-KWAS-H...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Her presenterer vi en protokoll for å generere en proof-of-prinsippet toverdig adenovirus type 5 (Ad5) vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ved å utnytte Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi. Denne vektor ble vist å oppvise kvalitativt kondisjon, evnen til å unnslippe Ad5-positive sera in vitro, og antigenisiteten og immunogenisiteten til de inkorporerte antigener.

Utnytte Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi for utvikling av Adenovirus Serotype 5-vectored Vaksine tilnærminger

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Effektiv Rekombinant Parvovirus Produksjonen ved hjelp av Adenovirus deriverte Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generasjon av rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkjente Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Ved hjelp Klikk kjemi å måle effekten av virusinfeksjon på Host-Cell RNA syntese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Vurdere utvikling av Murint Plasmacytoid dendrittiske celler i Peyer sin Patches Bruke Adoptive Overføring av Hematopoietic stamfedre

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse av MyD88-mediert cellulær immunrespons til West Nile Virus Mutant Strain Infeksjon

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Påvisning av humant leukocytt antigen Biomarkører i Breast Cancer Utnytte Etikett-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃƒÅ½Ã‚ÂµRI

Utvikling av en<em&gt; In vitro</em&gt; Modellsystem for å studere samspillet mellom<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE med sin high-affinitetsreseptor FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imaging CD4 T Cell Interstitiell Migrasjon i Betente dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utvikling av stamcelle-avledet Antigen-spesifikke Regulatoriske T-cellene mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utvikling av en hepatitt B virus Reporter system for å overvåke tidlige stadier av Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...