Name: utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health concede 5T32AI7493-20 e 5R01AI089337-03. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

A Universidade de Alabama em Birmingham Institucional Uso de Animais e Cuidados Comissão aprovou o uso de ratos como aqui descrito sob o número de protocolo aprovado 101.109.272. 1. Genético Construção de um plasmídeo modificado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 com a Estratégia Capsid-Incorporação Antigen <ol><li> Construção do plasmídeo de transporte 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5- <ol><li> Peça um plasmídeo contendo a sequência de ADN sintetizada HVR1-Kwa...

<ol>
	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

A aplicação da estratégia do transgene tradicional em Ad5 modificação para o desenvolvimento de vacinas tem sido diminuído, principalmente devido ao estrangulamento associada com o Ad5 de PEI 4,6. Este gargalo pode ser parcialmente diminuída pela aplicação da estratégia alternativa antígeno do capsídeo-Incorporation (Figura 1A), uma vez que esta estratégia pode fugir neutralização por Ad5 NAbs substituindo neutralizantes epítopos de Ad5 com antígenos-de-interesse, e facilitar...

Adenovírus humano (Ad) é, um vírus de tamanho médio não encapsulado com uma nucleocápside icosaédrica que contém um genoma de ADN de cadeia dupla. Ad pertence à família Adenoviridae, com uma classificação em sete grupos (A a G). Cada grupo contém vírus de diferentes serótipos. Dos quais, adenovírus serotipo 5 (Ad5) do grupo C tem sido o mais extensamente estudado e o mais amplamente aplicado para abordagens vectored como terapia genética e vacinação. A estratégia transgene tradicional tem sido desenvolvido e aplicado para modificações de Ad5, que se caracteriza por o deslocamento dos genes precoces do vírus com um gene de interesse, e a expressão do gene focado de interesse num hospedeiro. Exemplos são a construção de pENV9 / Ad5hrΔE3 por substituição do gene inicial 3 (E3) com o gene rev de Simian Vírus da Imunodeficiência 1, a construção de AdCMVGag através da substituição do gene precoce 1 (E1) com o gene gag de Imunodeficiência HumanaVirus (HIV) 2, e a construção de lac Z por Ad substituindo E1 com o gene lac Z 3. A ampla aplicação da estratégia tradicional transgene em Ad5 depende dos seguintes méritos: a ampla gama de hospedeiros para Ad5, a engenharia genética viável sobre o vírus e propagação de vírus, o grande alojamento de inserção de genes estranhos ea segurança de Ad5 4,5. No entanto, as eficiências reduzidas de terapias clínicas Ad5-vectored por utilização desta estratégia tem sido um importante ponto de estrangulamento, que tem sido mapeada para ser associado principalmente com Ad5 PEI, uma vez que o Ad5 é tão prevalente entre a maioria de crianças e adultos 4,6. Para vencer o principal estrangulamento de Ad5, o objetivo principal é desenvolver uma estratégia alternativa contornar Ad5 PEI. A imunidade inata 7, a imunidade adaptativa, tais como anticorpos neutralizantes (NAbs) 8-10 e CD8 + T respostas de células 10 contra Ad5 têm sido mostrados para contribute ao Ad5 PEI, com Ad5 NAbs aparecendo para desempenhar o papel dominante nas contribuições para Ad5 PEI 10,11. Além disso, Ad5 NABS epítopos alvo situadas em proteínas do capsídeo, incluindo o principal hexon proteínas, fibras e base penton. Dos quais, hexon é o principal alvo de Ad5 NAbs 8,11-13. Com base nestes resultados, uma estratégia de incorporação de antigénio da cápside inovadora foi introduzida. Esta nova estratégia destaca a substituição ou incorporação de proteínas-de-juros sobre proteínas do capsídeo de Ad5, que desloca ou mascara os epítopos neutralizantes Ad5, levando à diminuição do reconhecimento pelo NAbs e eficientes administrações vetor Ad5. É de salientar que esta estratégia é competitivo, porque ele também pode ajudar anfitriões provocar imunidade humoral robusta e imunidade celular potente diretamente por apresentar antígenos de interesse para o sistema imunológico 4,14,15. Com base nesta estratégia, a clonagem molecular e salvamento recombinante Ad vetor viral pode ser estruturalmente divididaem quatro etapas principais: (a) a preparação de fragmento do gene de interesse por qualquer reação em cadeia da polimerase (PCR) ou síntese; (B) a ligação do fragmento do gene num plasmídeo de transporte que contém o fragmento do gene de interesse e os braços homólogas a uma espinha dorsal adenovírus; (C) a recombinação homóloga por co-transformação do plasmideo de transporte contendo o fragmento do gene de interesse com a espinha dorsal do plasmídeo linearizado pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) a transfecção de plasmídeo linearizado adenovírus recombinante para resgatar o vector Ad recombinante incorporado com antigénios-de-interesse. O nosso grupo e alguns outros já estendeu essa estratégia alternativa incorporação anúncio para Ad desenvolvimento da vacina vetorizada contra diferentes agentes infecciosos. Nós relataram a geração de um vector Ad recombinantes Ad-HVR1-LGS-His 6 -v3 por incorporação de um marcada com His de HIV-1 de antigénio para a região V3 de Ad5 HVR1 hexon (hexon5). Este vector gerado desencadeada strong resposta imunitária humoral específica para o epítopo V3 4. Também relatou o desenvolvimento de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 através da incorporação de HIV-1 de membrana região ectodomï¿½io proximal (MPER) na localidade de HVR2 hexon5 2. Além disso, o grupo do Dr. Zhou utilizou os benefícios desta estratégia de incorporação de anúncios para desenvolver serotipo ad 3 (Ad3) vacinas vetoriais, isto é., A geração do vector viral R1SP70A3 por incorporação de um epitopo neutralizante de SP70 Enterovírus 71 na HVR1 de Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 gerado NAbs fortes e produção de IFN-γ específicos para o epitopo SP70, que levam à alta taxa de protecção contra o desafio 15 71 Enterovírus. Para efeitos de referência técnica, nosso estudo se aproveitou da estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação qualitativa para se concentrar na geração de um bivalente Ad5 vetor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, incorporando um antígeno HIV-1 em HVR1 umda sua tag em HVR5 de hexon5. O vector viral gerada foi também avaliada imunologicamente. A estratégia de antigénio da cápside-A incorporação pode ser utilizada para o desenvolvimento de abordagens de vacinação contra o Ad5-vectored doenças infecciosas diferentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

O adenovírus serotipo 5 (Ad5) tem sido extensivamente modificado com métodos tradicionais de transgenes para o desenvolvimento de vacinas. As eficiências reduzidas destes vectores Ad5 tradicionalmente modificados em ensaios clínicos que se correlacionam principalmente com Ad5 imunidade pré-existente (PEI) entre a maioria da população. Para promover o desenvolvimento da vacina vetorizada-Ad5, resolvendo a preocupação de Ad5 PEI, tem sido utilizada a inovadora estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Por mérito desta estratégia, Ad5-vectored que primeiro construiu o shuttle hexon plasmídeo HVR1-Seus Kwas-HVR5-6 / pH5S por subclonagem da região hipervariável (HVR) 1 de hexon num plasmídeo de transporte previamente construído HVR5-His 6 / pH5S, que tinha Sua 6 tag incorporada no HVR5. Este fragmento de DNA contendo um epitopo HVR1 ELDKWAS HIV foi sintetizado. 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5-se então linearizado e co-transformada com o plasmídeo linearizado pAd5 backbone / ΔH5 (GL),para recombinação homóloga. Este plasmídeo recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His foi transfectado em células para gerar o vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Este vector foi validado para ter aptidão qualitativa indicado pelo título viral física (VP / ml), título infeccioso (IP / ml) e correspondente rácio / IP VP. Tanto o epitopo HIV e Sua 6 tag foram sobre a cápside de Ad5 expostos à superfície, e manteve-epítopo específico antigenicidade da sua própria. Um ensaio de neutralização indicada a capacidade deste vector para contornar divalente de neutralização pelo soro de Ad5-positiva, in vitro. A imunização de camundongos demonstraram a geração de robusta imunidade humoral específica para o epitopo HIV e Sua 6. Este estudo de prova de princípio sugerido que o protocolo associado com a estratégia de antigénio da cápside-Incorporação poderia ser viável utilizado para a geração de vacinas de Ad5-vectored diferentes, modificando as proteínas da cápside. Este protocolo poderia até ser futros modificado para a geração de rara do serotipo vacinas em vector-adenovírus.

A estratégia de antigénio da cápside-Incorporação (Figura 1A), foi utilizada para gerar o vector viral Ad5 divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Em primeiro lugar, o ônibus plasmídeo HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S foi construído por subclonagem HVR1-Kwas fragmento no plasmídeo anterior shuttle construído HVR5-His 6 / pH5S 17. Em segundo lugar, o plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-His-6 14 foi construído através da recombinaç...

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Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um bivalente adenovírus tipo 5 (Ad5) vector de prova de princípio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, utilizando a estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Este vector foi demonstrado que exibem aptidão qualitativa, a capacidade de escapar soros Ad5-positiva, in vitro, e a antigenicidade, bem como a imunogenicidade dos antigénios incorporados.

Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Imunologia e Infecção

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Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

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Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

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In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Detecção de Leucócitos Humanos Antigen Biomarkers no cancro da mama Utilizando tecnologia de biossensores livre-Label

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃƒÅ½Ã‚ÂµRI

Desenvolvimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo para estudar a interacção de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...