Name: utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00
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Esta obra fue financiada en parte por los Institutos Nacionales de Salud otorga 5T32AI7493-20 y 5R01AI089337-03. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.

La Universidad de Alabama en Birmingham Institucional Animal Uso y Cuidado Comité aprobó el uso de ratones como se describe en el presente documento con el número de protocolo aprobado 101.109.272. 1. Genética Construcción de un plásmido modificado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 con la Estrategia de la cápside-Incorporación Antígeno <ol><li> La construcción del plásmido lanzadera 6 / pH5S Sus HVR1-Kwas-HVR5- <ol><li> Pedido un plásmido que contiene la secue...

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	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

La aplicación de la estrategia tradicional transgén en la modificación de Ad5 para el desarrollo de vacunas se ha disminuido debido principalmente al cuello de botella asociado con el Ad5 PEI 4,6. Este cuello de botella puede ser parcialmente disminuido por la aplicación de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación (Figura 1A) alternativo, ya que esta estrategia puede evadir la neutralización por Ad5 NAbs reemplazando neutralizantes epítopos de Ad5 con antígenos de inter...

Adenovirus humano (Ad) es un virus de tamaño medio sin envoltura con una nucleocápside icosaédrica que contiene un genoma de ADN de cadena doble. Ad pertenece a la familia Adenoviridae, con una clasificación en siete grupos (A a G). Cada grupo contiene virus de diferentes serotipos. De los cuales, adenovirus serotipo 5 (Ad5) del grupo C ha sido el más estudiado y el que más se aplica para los enfoques vectored como la terapia génica y vacunas. La estrategia transgén tradicional ha sido desarrollado y aplicado para las modificaciones de Ad5, que se caracteriza por el desplazamiento de los genes tempranos de virus con un gen de interés, y la expresión del gen de centrado de intereses en un huésped. Ejemplos de ello son la construcción de pENV9 / Ad5hrΔE3 mediante la sustitución de gen temprano 3 (E3) con el gen rev de Simian Virus de Inmunodeficiencia 1, la construcción de AdCMVGag mediante la sustitución de gen temprano 1 (E1) con el gen gag de la Inmunodeficiencia HumanaVirus (HIV) 2, y la construcción de Ad lac Z mediante la sustitución de E1 con lac Z gen 3. La amplia aplicación de la estrategia tradicional transgén en Ad5 depende de los siguientes méritos: la amplia gama de anfitriones para Ad5, la factible ingeniería gen en el virus y la propagación de virus, la gran alojamiento de inserto de gen extraño y la seguridad de Ad5 4,5. Sin embargo, los reducidos eficacias de terapias clínicas vectored-Ad5 por el uso de esta estrategia ha sido un importante cuello de botella, que ha sido asignada para ser asociado principalmente con Ad5 PEI, ya Ad5 es tan frecuente entre la mayoría de los niños y los adultos 4,6. Para superar el principal cuello de botella de Ad5, el objetivo principal es el desarrollo de una estrategia alternativa eludir Ad5 PEI. La inmunidad innata 7, la inmunidad adaptativa, tales como anticuerpos neutralizantes (NABS), 8-10 y T CD8 + respuestas de las células 10 contra Ad5 se ha demostrado que contribute al Ad5 PEI, con Ad5 NAbs apareciendo a desempeñar el papel dominante en las contribuciones al Ad5 PEI 10,11. Por otra parte, Ad5 Nabs epítopos objetivo situadas en proteínas de la cápside, incluidos el principal hexón proteínas, fibra y base de pentón. De los cuales, hexón es el objetivo principal de Ad5 NAbs 8,11-13. Basándose en estos hallazgos, una innovadora estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación se ha introducido. Esta nueva estrategia destaca la sustitución o incorporación de proteínas de intereses en las proteínas de la cápside Ad5, que desplaza o máscaras de los epítopos neutralizantes Ad5, que conduce a la disminución de reconocimiento por parte de las administraciones y NAbs vector Ad5 eficientes. Es de destacar que esta estrategia es competitivo ya que también puede ayudar a hosts provocar inmunidad humoral y la inmunidad celular robusto potente mediante la presentación de antígenos directamente-de-interés para el sistema inmune 4,14,15. Basado en esta estrategia, la clonación molecular y rescate Ad vector viral recombinante se pueden dividir estructuralmenteen cuatro pasos principales: (a) la preparación de fragmento de gen de interés ya sea por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o síntesis; (B) la ligación de fragmento de gen en un plásmido lanzadera que contiene el fragmento del gen de interés y los brazos homólogas a una cadena principal de adenovirus; (C) la recombinación homóloga por la co-transformación del plásmido lanzadera que contiene el fragmento del gen de intereses con el plásmido linealizado backbone pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) la transfección de plásmido linealizado adenoviral recombinante para rescatar el vector Ad recombinante constituida con antígenos de intereses. Nuestro grupo y algunos otros han extendido esta estrategia de incorporación de anuncio alternativo para Ad desarrollo de la vacuna vectorizada contra diferentes agentes patógenos infecciosos. Nos informó la generación de un vector recombinante Ad Ad-HVR1-LGS-Su 6 -V3 incorporando un Su-etiquetados VIH-1 antígeno V3 en la configuración regional HVR1 de Ad5 hexón (hexon5). Este vector generado desencadena strong respuesta inmune humoral específica para el epítopo V3 4. También informó el desarrollo de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 incorporando el VIH-1 membrana región ectodominio proximal (MPER) en la configuración regional HVR2 de hexon5 2. Además, el grupo del Dr. Zhou ha utilizado los beneficios de esta estrategia de incorporación Ad desarrollar Ad serotipo 3 (Ad3) vacunas vectorizadas, es decir., La generación de vectores R1SP70A3 viral mediante la incorporación de un SP70 epítopo neutralizante de Enterovirus 71 en el HVR1 de Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 generado NAbs fuertes y la producción de IFN-γ específicas para el epítopo SP70, que conducen a la alta tasa de protección contra Enterovirus 71 15 desafío. A los efectos de referencia técnica, nuestro estudio se aprovechó de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación cualitativa para centrarse en la generación de un vector Ad5 divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la incorporación de un antígeno del VIH-1 en HVR1 unda His en HVR5 de hexon5. El vector viral también fue generada inmunológicamente evaluado. La estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación podría ser utilizado para el desarrollo de enfoques de vacunación vectored-Ad5 contra diferentes enfermedades infecciosas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

Adenovirus de serotipo 5 (Ad5) ha sido ampliamente modificado con métodos tradicionales de transgén para el desarrollo de vacunas. Las eficacias reducidas de estos vectores Ad5 tradicionalmente modificados en los ensayos clínicos podrían ser correlacionados principalmente con Ad5 inmunidad pre-existente (PEI) entre la mayoría de la población. Promover el desarrollo de vacunas Ad5-vectored resolviendo la preocupación de Ad5 PEI, la innovadora estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación se ha empleado. Por mérito de esta estrategia, Ad5 vectored-que primero construyó el transbordador hexón plásmido HVR1-Sus Kwas-HVR5-6 / pH5S subclonando la región hipervariable (HVR) 1 de hexón en un plásmido lanzadera previamente construido HVR5-His 6 / pH5S, que tenía Su etiqueta 6 incorporado en el HVR5. Se sintetizó Este fragmento de ADN que contiene un epítopo de HVR1 ELDKWAS VIH. 6 / pH5S Sus HVR1-Kwas-HVR5-Fue entonces linealizado y co-transformada con el plásmido linealizado backbone pAd5 / ΔH5 (GL),para la recombinación homóloga. Este plásmido recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 6-His se transfectó en células para generar el vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 6-His. Este vector fue validado para tener la aptitud cualitativa indica viral título física (VP / ml), título infeccioso (IP / ml) y la correspondiente relación / IP VP. Tanto el epítopo VIH y His 6 estaban en la cápside Ad5 expuesto en la superficie, y retenidos antigenicidad epítopo específico de los suyos. Un ensayo de neutralización indica la capacidad de este vector divalente para eludir la neutralización por sueros Ad5-positivo in vitro. Inmunización ratones demostró la generación de robusta inmunidad humoral específica al epítopo de VIH y su 6. Este estudio de prueba de principio sugirió que el protocolo asociado con la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación podría ser factible utilizar para la generación de vacunas vectorizadas-Ad5 mediante la modificación de diferentes proteínas de la cápside. Este protocolo podría incluso ser fás modificado para la generación de vacunas de adenovirus-vectorizada raras serotipo.

La estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación (Figura 1A) se utilizó para generar el vector viral divalente Ad5 Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 6-His. En primer lugar, el servicio de transporte plásmido HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 / pH5S se construyó subclonando fragmento HVR1-Kwas en el anterior plásmido lanzadera construida HVR5-Su 6 / pH5S 17. En segundo lugar, el plásmido pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14 fue construido por una recomb...

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Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

A continuación, presentamos un protocolo para generar un adenovirus divalente tipo 5 (Ad5) vectores de prueba de principio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la utilización de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. Este vector se demostró la aptitud para exhibir cualitativa, la capacidad de escapar de sueros Ad5-positivo in vitro, y la antigenicidad, así como la inmunogenicidad de los antígenos incorporados.

La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

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