Name: three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

<ol>
	<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays.">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li><li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma:+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling.">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device.">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).</li><li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+the+microenvironment:+plasticity+and+reciprocity.">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li><li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion.">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415 (2009).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems:+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model.">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li><li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li><li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells.">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).</li><li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels.">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation.">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li></ol>

सभी लेखक ब्याज की कोई प्रतिस्पर्धा संघर्ष की घोषणा।

यहाँ वर्णित दो ट्यूमर मॉडल (ग्लियोब्लास्टोमा और SCCHN) विशेष रूप से वे चिकित्सकीय प्रभावी उपचार 12 के लिए एक unmet की आवश्यकता के साथ प्रासंगिक स्थानीय रूप से आक्रामक कैंसर के रूप में हमारे 3 डी परख उदाहरण देना करने के लिए चयन किया गया था। नशीली दवाओं के उपचार, इन विट्रो pharmacodynamic (पीडी) बायोमार्कर परिवर्तन के आकलन BMM और / या पूरे द्वारा ट्यूमर spheroids हमलावर की Immunofluorescent विश्लेषण से सेल वसूली की अनुमति के लिए विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों के उपयोग के बाद पश्चिमी धब्बा या lysates के immunoassays द्वारा आसानी से किया जा सकता है निम्नलिखित माउंट धुंधला हो जाना। इस आक्रमण परख एक उपयोगी एक semisolid माध्यम में ट्यूमर सेल आक्रमण के तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन के लिए तकनीक और इन विट्रो दवा स्क्रीनिंग में भविष्य के लिए इसलिए विशेष रूप से उपयुक्त है। कैंसर की कोशिकाओं को वे ट्यूमर अंडाकार आकृति के प्रतिनिधित्व वाले एक &quot;सूक्ष्म ट्यूमर&quot;, से बाहर फैल के रूप में एक 3 डी ढंग से मैट्रिक्स आक्रमण है, और एक extracellul में विस्तारगिरफ्तारी मैट्रिक्स की तरह पर्यावरण। परख का असली तीन आयामी स्वरूप एक ठोस सब्सट्रेट पर चलती है जब कोशिकाओं मान फ्लैट, पक्षपाती आकृति विज्ञान से अलग है, जो सेल आकृति विज्ञान, में स्पष्ट है। आक्रमण की डिग्री आसानी से, या इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में एक मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक स्वचालित पढ़ने के लिए बाहर की अनुमति देता है, कोशिकामापी एक इमेजिंग या तो उपयोग मात्रा निर्धारित है। इसके अलावा, इस विधि उपयुक्त है फ्लोरोसेंट इमेजिंग 13 के लिए (फ्लोरोसेंट प्रोटीन या व्यक्त सेल लाइनों के साथ उदाहरण के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के साथ पूर्व लेबल)। में अंडाकार आकृति के मध्य स्थिति को परेशान करने के लिए एक खतरा नहीं है जब विधि BMM, के अलावा द्वारा प्रतिनिधित्व ही महत्वपूर्ण कदम के साथ प्रदर्शन करने के लिए सरल है अच्छी तरह से यू के आकार का। यह अलग फोकल विमानों में spheroids के साथ, उपअनुकूलित छवि विश्लेषण में परिणाम कर सकते हैं। यह अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ध्यान से और धीरे धीरे BMM जोड़ने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। BMM अलावा के बाद यह थाली जाँच करने के लिए सलाह दी जाती हैस्थानीयकरण अस्वीकार्य माना जाता है अगर एक खुर्दबीन के नीचे और, इस कोमल centrifugation द्वारा remedied किया जा सकता है। अनुभव के साथ, यह शायद ही कभी आवश्यक है। इस विधि मजबूत और बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है जबकि, अंतर प्रयोगात्मक भिन्नता BMM के विभिन्न बैचों के साथ हो सकता है। इससे बचने के लिए, यह अध्ययन की एक श्रृंखला को पूरा करने के लिए एक ही बैच से पर्याप्त BMM खरीद करने के लिए सलाह दी जाती है। विधि की एक सीमा है (किसी भी तरह के assays के लिए) के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं की संभावना परख समय सीमा के दौरान गुजरना जो आक्रमण और प्रसार के बीच भेद करने में कठिनाई है। कोशिकाओं के दोहरीकरण के समय को ध्यान में रखा, या ऐसे cytochalasin डी के रूप में सेल चक्र अवरोधकों को पेश किया जा सकता है, इसे नियंत्रित या स्पष्ट रूप से विशेष रूप से तेजी से बढ़ ट्यूमर कोशिकाओं के लिए और उन लोगों के लिए, ट्यूमर प्रगति के इन दो अलग-अलग पहलुओं के बीच भेद करने के लिए आसान नहीं है एक अधिक &quot;विशाल&quot;, बजाय infiltrative, आक्रमण पैटर्न है। इस कारण सेयह एक समानांतर 3 डी विकास परख किसी भी निरोधात्मक या उत्तेजक एजेंटों के विशिष्ट प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है कि सुझाव दिया है। सावधान खुराक प्रतिक्रिया पढ़ाई प्रदर्शन कर रहे हैं, यह प्रसार पर प्रभाव को कम सांद्रता है कि चयन करने के लिए संभव हो सकता है। उदाहरण के लिए हम HSP90 17-ए ए जी 50% (सैनिक 50) को 12 से 3 डी विकास में बाधा 24 घंटा में और एकाग्रता से नीचे सांद्रता में पहले से ही यू-87 एमजी 3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण को रोकता अवरोध करनेवाला दिखाया है। दूसरी ओर, इस परख के महत्व अन्य मानक आक्रमण assays (उदाहरण के लिए, फिल्टर आधारित assays या 3 डी मेट्रिसेस 1 में एकल कक्षों के आक्रमण) की तुलना में, ट्यूमर कोशिकाओं को एक जैसा होता है, अंडाकार आकृति से आसपास के मैट्रिक्स में आक्रमण करता है &quot; इसलिए सूक्ष्म ट्यूमर &quot;या एक&quot; सूक्ष्म मेटास्टेसिस &quot;, और एक ट्यूमर जन के pathophysiology के खाते में महत्वपूर्ण पहलुओं में ले जाता है। हम वर्तमान पद्धति के बारे में जानकारी प्रदान करता हैशुरू में spheroids छोड़ रहा है, और यह भी व्यक्तिगत रूप से, एकल कक्षों BMM में अधिक सुदूर क्षेत्रों तक पहुँच जाने पर जब ट्यूमर कोशिकाओं, के सामूहिक व्यवहार। इसके अतिरिक्त, ट्यूमर spheroids के भीतर कोशिकाओं हाइपोक्सिया और पोषक तत्वों के अभाव का अनुभव हो सकता है, जो जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के माध्यम से, प्रवास और आक्रमण को बढ़ावा देने के कर सकते हैं; ऐसी सुविधाओं 2D assays में अनुपस्थित रहे हैं। इसके अलावा, इस सब के लिए एक अधिक जटिल 3D परख आसानी से लक्ष्य सत्यापन और दवाओं की खोज में इस्तेमाल किया जा करने की इजाजत दी, विशिष्ट 96 अच्छी तरह से प्लेटों के उपयोग के माध्यम से एक उच्च throughput प्रारूप और नवीनतम इमेजिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में उपलब्ध है। हम वर्तमान पद्धति ट्यूमर सेल आक्रमण के अतिरिक्त पहलुओं का पता करने के लिए आगे आवेदनों को समायोजित कर सकते हैं। विशेष रूप से, अतिरिक्त जटिलता अंडाकार आकृति अपने आप में या आसपास के मैट्रिक्स में, इस तरह के fibroblasts और / या endothelial कोशिकाओं के रूप में मेजबान कोशिकाओं, के अलावा द्वारा परिकल्पित किया जा सकता है। यह भी कठोरता के मामले में (विभिन्न सह के इस्तेमाल से न केवल संशोधित किया जा सकता हैBMM की ncentrations), लेकिन यह भी रचना के संदर्भ में (अपनाया ट्यूमर मॉडल के विशिष्ट ऊतक / अंग पर निर्भर अन्य घटकों के अलावा द्वारा: स्तन कार्सिनोमा 17) के लिए मस्तिष्क के कैंसर के 16 और कोलेजन के लिए उदाहरण के लिए, tenascin। (Spheroids और इमेजिंग की पीढ़ी) एक समान सेट-अप भी ट्यूमर spheroids या अन्य सेल विशिष्ट organoids (उदाहरण के लिए, astrocytes के साथ एक जटिल ऊतक 12 जैसी embryoid निकायों के साथ सह-संवर्धित कर रहे हैं, जहां 3 डी में ऊतक आक्रमण का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है तंत्रिकाबंधार्बुद 18 या तहखाना गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर के लिए संस्कृतियों), लेकिन आगे काम स्वचालित छवि विश्लेषण सक्षम करने के लिए आवश्यक है।

शास्त्रीय कैंसर विरोधी दवा के विकास ट्यूमर सेल प्रसार रोकना और / या क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (एपोप्टोसिस) को बढ़ावा देने कि साइटोटोक्सिक एजेंटों के लिए स्क्रीन करने के लिए इन विट्रो सेल आधारित assays के उपयोग पर काफी हद तक ध्यान केंद्रित है। हाल ही में, के प्रयासों घातक सेल प्रसार की अंतर्निहित आणविक कारणों में से अवरोधकों के विकास के साथ लक्षित चिकित्सा की ओर चले गए हैं। कुछ शानदार परिणाम के बावजूद, इस तरह के एजेंटों अक्सर दवा प्रतिरोध का तेजी से विकास के साथ जुड़े रहे हैं। यह कैंसर से होने वाली मौतों के बहुमत के लिए जिम्मेदार है कि ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक और मेटास्टेटिक संभावित है, और कहा कि relapsed बीमारी अक्सर, यह इन विट्रो प्रयोगात्मक मॉडल उपन्यास की पहचान करने के लिए 1,2 में पूरक विचार करने के लिए भी तार्किक है एक और अधिक आक्रामक फेनोटाइप प्रस्तुत करता है यह देखते हुए कि कैंसर के इन अतिरिक्त कुंजी &#39;पहचान&#39; को बाधित करेगा कि एजेंटों। घातक प्रगति के दौरान, ट्यूमर कोशिकाओं का अधिग्रहणआसपास के ऊतकों पर आक्रमण और / या दूर के अंगों (मेटास्टेसिस) में फैल करने की क्षमता। कैंसर की कोशिकाओं को invadopodia 3,4 के गठन के द्वारा तहखाने झिल्ली घुसना। इन संरचनाओं एक्टिन filaments, विशिष्ट आसंजन प्रोटीन और proteinases के साथ समृद्ध और सामूहिक रूप से ट्यूमर सेल गतिशीलता और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 5 की गिरावट के लिए जिम्मेदार होते हैं। Invadopodia ईसीएम में विस्तार और ट्यूमर सेल आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और भी hematogenous (या लसीका) प्रसार और मेटास्टेसिस को सुविधाजनक बनाने, नाड़ी चैनलों में परिस्त्राव माना जाता है। वर्तमान मानक तरीकों का पालन शामिल इन विट्रो में ट्यूमर सेल आक्रमण का आकलन करने के लिए। Transwell के आधार पर या Boyden कक्ष assays के एकल कक्ष निलंबन ईसीएम व्युत्पन्न प्रोटीन की एक मोटी परत के साथ लेपित एक फिल्टर के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, जहां 2,6। कोशिकाओं तो आक्रमण और एक केमो-attractant के जवाब में निचले सदन में चलते हैं। आमतौर पर इस्तेमाल किया ईसीएमप्रोटीन I कोलेजन प्रकार के होते हैं, या तहखाने झिल्ली की प्राकृतिक संरचना mimics कि (EHS ट्यूमर 7 से निकाली गई BMM, जैसे, Matrigel,) एक तहखाने झिल्ली की तरह मैट्रिक्स। फिल्टर आधारित Boyden कक्ष प्रकार assays के 8 के लिए एक विकल्प के रूप में, कोशिकाओं वे जेल में आक्रमण व्यक्तिगत रूप से या सामूहिक रूप से तो एक monolayer और फार्म जहां (fibroblasts जोड़ा जा सकता है जो करने के लिए) एक ईसीएम जेल के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। आक्रमण जेल सतह 9 से कूच हमलावर कोशिकाओं और / या दूरी की संख्या के संदर्भ में मापा जा सकता है। आमतौर पर कोशिकाओं के आसपास के मैट्रिक्स 2,6,10,11 में ट्यूमर जन से बाहर आक्रमण करने की इजाजत दी ईसीएम gel- की दो परतों के बीच रखा गया - ट्यूमर कोशिकाओं को भी पूरी तरह से एक मैट्रिक्स में या तो एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में या spheroids के रूप में एम्बेड किया जा सकता है। यहाँ वर्णित तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण परख एक highl का उपयोग कर एक तेजी से, automatable आक्रमण प्रणाली प्रदान करता हैअच्छी तरह से प्रति एक अंडाकार आकृति के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में y प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, मानकीकृत विधि 12। BMM ट्यूमर कोशिकाओं अंडाकार आकृति शरीर से आक्रमण में जो एक अर्द्ध ठोस मैट्रिक्स प्रदान करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सीधे जोड़ा गया है। 96 घंटा - ट्यूमर सेल आक्रमण की हद तक 72 की अवधि में अंतराल पर नजर रखी है। इस विधि से ऊपर उल्लेख किया है वर्तमान में इन विट्रो आक्रमण assays पर निम्न लाभ प्रदान करता है: कोशिकाओं को एक ट्यूमर सूक्ष्म क्षेत्र या एक सूक्ष्म मेटास्टेसिस नकल उतार एक 3 डी संरचना में आयोजित कर रहे हैं ट्यूमर; ट्यूमर spheroids आकार में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं; आक्रमण परख माध्यमिक प्लेटों के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए आवश्यकता के बिना, ट्यूमर अंडाकार आकृति विकास के रूप में एक ही थाली में बगल में किया जाता है; स्वचालित छवि विश्लेषण की नवीनतम तकनीकों के साथ संयुक्त विधि, दोनों उच्च सामग्री के लिए सक्षम बनाता है और उच्च throughput ट्यूमर सेल आक्रमण का विश्लेषण करती है। छवि विश्लेषण एक 96 अच्छी तरह से स्कैन करता है जो कोशिकामापी एक इमेजिंग, का उपयोग किया जाता है10 मिनट के भीतर थाली। संगम आवेदन का उपयोग करके, सीमा और आक्रमण की दर एकल कक्षों से या सेल समूहों ट्यूमर spheroids से बाहर फैल रहा है और एक गतिशील फैशन में मापा जा सकता है मैट्रिक्स में हमलावर द्वारा या तो हासिल की। कम throughput के लिए, छवि विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक औंधा माइक्रोस्कोप और मानक इमेजिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग पर आधारित है, प्रस्तुत किया है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:297px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Web address</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354234</td>
			<td>http://www.corning.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td style="width:161px;">Trevigen</td>
			<td style="width:135px;">3432-005-01</td>
			<td>http://www.trevigen.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultra-low attachment 96-well plate</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">7007</td>
			<td>http://www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">EGF</td>
			<td style="width:161px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-093-825</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com 
			Add 100 &#181;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &#181;g EGF. To 25 &#181;l of this, add 4,975 &#181;l RHB-A medium to give a 10 &#181;g/ml working stock. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RHB-A medium</td>
			<td style="width:161px;">Stem Cells Inc.</td>
			<td style="width:135px;">SCS-SF-NB-01</td>
			<td>http://www.stemcellsinc.com 
			For diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">31966-021</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Biosera</td>
			<td style="width:135px;">1001/500</td>
			<td>http://www.biosera.com 
			Heat at 56 &#176;C to inactivate complement before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">12605</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">Celigo cytometer</td>
			<td style="width:161px;">Nexcelom Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.nexcelom.com 
			Specialist equipment for image capture and analysis.&#160; Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IX70 inverted microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.olympus.co.uk/ 
			Used with camera for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:297px;">Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td>
			<td style="width:161px;">Qimaging</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.qimaging.com/ 
			Attached to microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Software used to control camera and microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Analyzer 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:161px;">Microsoft</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.microsoft.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Prism 6.0</td>
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		</tr>
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three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

ट्यूमर (सौम्य के खिलाफ) सामान्य आसपास के ऊतकों के आक्रमण आम तौर पर घातक की एक प्रमुख पहचान माना जाता है। विशेष रूप से कुछ तरह के कैंसर के लिए (। उदाहरण के लिए, इस तरह के ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म और सिर के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और गर्दन के रूप में मस्तिष्क ट्यूमर - SCCHN) यह गंभीर रुग्णता का एक कारण है और जीवन के लिए खतरा दूर मेटास्टेसिस के अभाव में भी हो सकता है। इसके अलावा, relapsed है जो कैंसरों दुर्भाग्य से अक्सर मौजूद एक और अधिक आक्रामक phenotype के साथ इलाज के बाद। इसलिए, मानक विरोधी प्रफलन एजेंटों के पूरक हो सकता है कि उपन्यास के उपचारों प्रदान करने के लिए आक्रमण करने की प्रक्रिया को लक्षित करने के लिए एक अवसर है। अब तक, इस रणनीति के आक्रमण का एक विस्तृत विश्लेषण के लिए और दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य assays के अभाव के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। यहाँ हम एक साधारण सूक्ष्म प्लेट विधि प्रदान (वर्दी के आधार पर स्वयं कोडांतरण 3 डी ट्यूमर spheroids) ऐसे छात्रों के लिए काफी क्षमता है जोमर जाता है। हम यह भी एक मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन और लक्षित epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) को अवरोधकों के खिलाफ प्रतिरोध के विकास बढ़ाया मैट्रिक्स आक्रामक क्षमता के साथ जुड़ा हुआ है, जहां एक SCCHN मॉडल का उपयोग परख मंच उदाहरण देना। कोशिकामापी एक इमेजिंग का उपयोग कर एक और केवल डिजिटल छवि विश्लेषण के साथ मानक माइक्रोस्कोपी और छवि पर कब्जा की आवश्यकता है जो एक दूसरे: हम भी अर्द्ध स्वचालित मात्रा का ठहराव के दो वैकल्पिक तरीकों प्रदान करते हैं।

3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण रेखाचित्र के रूप में चित्रा 1 में सचित्र एक सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्वचालित पद्धति का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है: reproducibly आकार के ट्यूमर spheroids ULA 96 अच्छी तरह से दौर नीचे प्लेटों में चढ़ाना कोशिकाओं द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। 4 दिनों के बाद दीक्षा spheroids BMM में एम्बेडेड रहे हैं। यह ट्यूमर कोशिकाओं पर आक्रमण और अंडाकार आकृति के बाहर फैल गया जिसमें एक अर्द्ध ठोस संरचना प्रदान करता है। कोशिकामापी एक इमेजिंग का उपयोग करते हुए 96 घंटा - spheroids BMM में अच्छी तरह से प्रत्येक का आधार है और आक्रमण पर केन्द्र स्थित हैं आसानी = 0 टी 72 से शुरू अंतराल पर नजर रखी है। यह पूरी तरह से स्वचालित छवि विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं। कैंसर सेल आक्रमण के विभिन्न प्रकार के उदाहरण आंकड़े 2 में सचित्र हैं -। 4 अत्यधिक घातक मानव ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म (जीबीएम) सेल लाइन अंडर 87 एमजी, एक चुस्त, गोलाकार 3 डी संरचना रूपों और मस्तिष्क ट्यूमर उदाहरण देना करने के लिए यहाँ प्रयोग किया जाता है स्थानीय जिसमें आक्रमण एक प्रमुख जीवन के लिए खतरा हैसुविधा। एक बार जब BMM में एम्बेडेड, एक ठेठ &quot;बर्स्ट&quot; आक्रमण पैटर्न 12 के साथ फैल यू-87 एमजी spheroids से कोशिकाओं। ट्यूमर कोशिकाओं त्रिज्यात वे एक 3-आयामी आकार को बनाए रखने में जो मैट्रिक्स में विस्तार। BMM में विस्तार सेलुलर प्रक्रियाओं का विवरण और invadopodia के साथ ट्यूमर सेल आक्रमण की हद, स्पष्ट रूप से स्पष्ट है, जब यू-87 एमजी spheroids के लिए चित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में इस प्रक्रिया को 72 घंटे की अवधि में पीछा किया जाता है। पूरी तरह से समय के साथ ट्यूमर सेल आक्रमण के सटीक quantitation के लिए सक्षम बनाता है कोशिकामापी एक छवि का उपयोग छवि विश्लेषण स्वचालित। स्वचालित विश्लेषण अंडर 87 एमजी अंडाकार आकृति शरीर से BMM में विस्तार सेल protrusions के चारों ओर विभाजन पैदा करता है, जहां चित्रा 1 में सचित्र के रूप में चित्रा 2 में मात्रा का ठहराव प्राप्त की है। इस सेल लाइन के लिए, ट्यूमर अंडाकार आकृति शरीर पर आक्रमण क्षेत्र की माप से बाहर रखा गया है कि ध्यान दें। Invas की एक अलग पैटर्नआयन मानव स्क्वैमस सिर और गर्दन के कैंसर कोशिका लाइनों के द्वारा प्रदर्शित किया गया था। सीएएल एस और काल आर isogenic हैं, लेकिन सीएएल एस के प्रति संवेदनशील है, और EGFR टाइरोसीन काइनेज अवरोधकों 14 के लिए प्रतिरोधी सीएएल आर। EGF के अभाव में न तो सेल लाइन BMM (चित्रा 3) EGF की एकाग्रता बढ़ गया था लेकिन, जैसा कि (2.5 एनजी / एमएल), spheroids &#39;कली&#39; के लिए प्रकट में हमला कर दिया। EGF (40 और 80 एनजी / एमएल) के आक्रमण की डिग्री के उच्च सांद्रता में कम हो गया था। यह पहले 15 सूचित किया गया है कि आक्रमण के मामले में EGF को शास्त्रीय घंटी के आकार खुराक प्रतिक्रिया के अनुरूप है। 20 एनजी में / एमएल EGF, सीएएल की कोशिकाओं whilst के सीएएल आर spheroids के मुख्य शरीर से extruded उंगली की तरह उभार 72 घंटा (चित्रा 3) के बाद कम आक्रामक थे। Spheroids सेल लाइनों के बीच अधिक से अधिक गौरव के लिए 20 एनजी / एमएल EGF युक्त BMM (में रखा गया था के बाद यह अंतर आक्रमण 48 घंटा स्पष्ट हो गया था) और 72 घंटे के बाद सबसे बड़ी (चित्रा 4)। इन छवियों को यू-87 एमजी के लिए के रूप में, कोशिकामापी एक इमेजिंग का उपयोग तेजी से हासिल किया गया। हालांकि, इस मामले में, एक वैकल्पिक तरीका उदाहरण देना करने के लिए, आक्रमण की डिग्री स्टैंड-अलोन छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मैन्युअल रूप से मात्रा निर्धारित किया गया था और रेखांकन भी प्रस्तुत किया जाता है (आंकड़े 3 और 4)। इन परिणामों के लिए विशेष रूप से दवा प्रतिरोधी, आक्रामक phenotype के विरोध करेगा कि यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि दवा के प्रति संवेदनशील और प्रतिरोधी कोशिकाओं के बीच एक प्ररूपी अंतर दर्शाने। <img alt="चित्र 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> 3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण परख के 1. योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा। कार्यप्रवाह सिर्फ BMM में एम्बेड करने के बाद विधि यू-87 एमजी ग्लियोब्लास्टोमा spheroids के प्रतिनिधि छवियों सहित शामिल कदम से पता चलता (शीर्ष पैनल, टी 0 =) और आक्रमण के बाद<html> BMM में, के साथ और हमलावर कोशिकाओं द्वारा कवर क्षेत्र उपाय है कि विभाजन के बिना (नीचे के पैनल टी 72 घंटा =)। बार = 100 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> के BMM। यू-87 एमजी में यू-87 एमजी ग्लियोब्लास्टोमा अंडाकार आकृति आक्रमण की चित्रा 2. समय पाठ्यक्रम BMM में 3 डी आक्रमण पर नजर रखी और कोशिकामापी एक इमेजिंग का उपयोग करते हुए 72 घंटा के लिए ऊपर मात्रा निर्धारित किया गया था, अंडाकार आकृति। (ए) प्रतिनिधि छवियों और (बी) मात्रा का ठहराव ट्यूमर सेल आक्रमण दिखाए जाते हैं। बार = 500 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> 3 पुनः &quot;src =&quot; / फ़ाइलें / ftp_upload / 52,686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; (प्रतिरोधी) चित्रा 3. सीएएल अनुसंधान और काल एस (संवेदनशील) ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण। (ए) प्रतिनिधि छवियों और (बी) EGF खुराक पर निर्भर सीएएल अनुसंधान और काल एस ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण का मार्गदर्शन मात्रा का ठहराव दिखाए जाते हैं। बार = 500 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> बी में रखा गया है जब चित्रा 4। सीएएल R से कोशिकाओं (प्रतिरोधी) spheroids सीएएल एस (संवेदनशील) ट्यूमर spheroids की तुलना में अधिक आक्रामक रहे हैंEGF उत्तेजना सीएएल आर ट्यूमर spheroids एक सीएएल एस की तुलना में अधिक स्पष्ट आक्रमण। (ए) प्रतिनिधि छवियों और (बी) के आक्रमण का मार्गदर्शन मात्रा का ठहराव दिखाने पर मिमी। दिखाए जाते हैं। बार = 500 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर उपगोल आक्रमण परख

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

Spheroid Assay to Measure TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-induced Invasion

उपगोल TGF-β प्रेरित आक्रमण उपाय परख

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

मानव मानव neuroendocrine ट्यूमर चिकित्सा के अध्ययन के लिए एक तीन आयामी मॉडल के रूप में neuroendocrine ट्यूमर सेल लाइनों

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

एक Organotypic मस्तिष्क टुकड़ा और कार्सिनोमा कोशिकाओं के 3 डी उपगोल साथ coculture प्रणाली

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

एक तीन आयामी (3 डी) मॉडल का उपयोग कर स्तन कैंसर कोशिका invasiveness की मात्रा

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

रीयल टाइम में mesothelial कोशिकाओं की डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल अनुलग्नक और आक्रमण का आकलन

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

ट्यूमर स्ट्रोमल इंटरेक्शन के लिए तीन आयामी सह संस्कृति मॉडल

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

कैंसर कोशिका उपगोल परख एक 3 डी सेटिंग में आक्रमण का आकलन करने के लिए

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद कोशिकाओं के तीन आयामी Alginate मनका संस्कृति

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

तीन आयामी संस्कृति परख कैंसर सेल invasiveness और सैटेलाइट ट्यूमर गठन का अन्वेषण करने के लिए

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

एक जटिल महाधमनी विसंगति के तीन आयामी मुद्रण

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...