Name: hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2Ã¢â‚¬â„¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مبادرة وزارة الصحة الكندية الجينوم بحوث والتنمية (GRDI) والاستراتيجية التنظيمية الكندية للتكنولوجيا الحيوية (CRSB). الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح.

التأكد من أن جميع تربية الحيوانات، والإسكان، والتعامل مع والتجريب الالتزام بالقواعد واللوائح المحلية وتمت الموافقة على أن بروتوكولات التجارب قبل البدء في أي دراسة. لوصف التجارب، تمت الموافقة على رعاية الحيوان، ومعالجة، والعلاج من قبل لجنة رعاية الحيوان وزارة الصح...

<ol>
	<li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+oxidation+matters:+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine.">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-hydroxy-2'+-deoxyguanosine+(8-OHdG):+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis.">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li><li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage:+formation,+measurement,+and+biochemical+features.">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li><li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer:+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature.">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li><li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li><li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., M&#248;ller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA.">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li><li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine:+implications+for+mutagenicity+and+repair.">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li><li>Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+(8-oxo-dGuo)+by+PAH+o-quinones:+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper(ii)/copper(i)+redox+cycling.">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li><li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress.">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li><li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+background+level+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine:+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up.">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li><li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice:+A+model+for+studying+mutations+in+vivo.">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li><li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+DNA+damage+is+associated+with+intense+noise+exposure+in+the+rat.">Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat.</a> Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).</li><li>European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+DNA+oxidation+in+human+cells+by+chromatographic+and+enzymic+methods.">Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods.</a> Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).</li><li>Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+and+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid.">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li><li>Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection:+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay.">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li><li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress.">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li><li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation.">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li><li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+urinary+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA.">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li><li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonising+measurements+of+8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine.">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA.">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAzol:+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA.">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li><li>Collins, A. R., Cadet, J., M&#246;ller, L., Poulsen, H. E., Vi&#241;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7,8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells.">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li><li>Badouard, C., M&#233;n&#233;zo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm.">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+DNA:+formation,+measurement+and+biochemical+features.">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).</li></ol>

على الرغم من أن 8 أوكسو dGuo تم الإبلاغ عن العلامات البيولوجية مفيدة للأكسدة الحمض النووي، يمكن تقدير لها موثوق تحديا. على الرغم من أن العديد من الطرق التي نشرت موجودة، وهناك حاجة ل، نظرة عامة وصفية شاملة للبروتوكول للسماح للباحثين لنشر الأسلوب في مختبراتهم. نحن هنا تق?...

تساهم أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، الذي مستويات ثابتة للدولة يمكن أن تزيد خلال العديد من الحالات المرضية والتمثيل الغذائي xenotoxic، إلى زيادة وتيرة الحمض النووي من التلف التأكسدي. بين عدة النووية nucleobases الممكنة منتجات الأكسدة، ويمكن أن الحمض النووي من التلف التأكسدي بسهولة أن تقاس باستخدام علامة مستقرة 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2&#39;-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo)، التي تعد واحدة من أشكال المؤكسد من 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-أوكسو dGuo هو آفة DNA الأكثر وفرة 2، وبالتالي، وقد درس لمزيد من التفاصيل والعلامات البيولوجية أكسدة الحمض النووي على الرغم من وجود الحمض النووي عدة منتجات الأكسدة 3. في البشر، وهذا الضرر يمكن إصلاحه عن طريق قاعدة إصلاح الختان بنسبة 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. إذا تركت دون إصلاح، ويمكن 8 أوكسو dGuo المساهمة في تشكيل قاعدة الطفرات الزوج إحلال (أي G إلى T transversions) 4. الأهم من ذلك، 8 أوكسو dGuo هو علامة المنشأة FOالحمض النووي من التلف (ص) في ما يتعلق استهلال وتعزيز التسرطن 2. ولذلك التقدير الدقيق 8 أوكسو dGuo هو العلامات البيولوجية مفيدة ومرغوبة من الحمض النووي من التلف التأكسدي 5. هناك ارتباك واسع النطاق في الأدبيات المتعلقة الأسماء الصحيحة لأشكال تلف oxidatively ل2-deoxyguanosine وعلاوة على ذلك، والاسم الصحيح للمجمع (ق) تقاس بشكل روتيني والعلامات البيولوجية من الحمض النووي من التلف التأكسدي 6. من 6،8-diketo و 6 إنول، 8-كيتوني أشكال صنواني من 8 أوكسو dGuo (كما هو موضح في الشكل رقم 1) هما tautomers أبرز مناقشتها في الأدب 5،7. شكل 6،8-diketo هو الشكل الأبرز في درجة الحموضة الفسيولوجية 7.4، و هو الأبرز أكسدة الحمض النووي المنتج 7. لذا، 8 أوكسو dGuo، بدلا من 8 هيدروكسي dGuo هو الاسم الأنسب لهذا المنتج أكسدة 6. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن 2-deoxyguanosine (dGuo)، بدلا من nucleobبورصة عمان جوانين (غواتيمالا) أو غوانوزين ريبونوكليوزيد (قوه) على التوالي، تم الكشف من قبل معظم وسائل 6. كشف دقيق وتقدير من 8 أوكسو dGuo يمثل تحديا للأسباب التالية: أ) التباين في الهضم من عينة من الحمض النووي، والثاني) الأكسدة عرضية من dGuo إلى 8 أوكسو dGuo التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات، والثالث) الحاجة للتحقق من صحة الفعال للالتحليلي طريقة HPLC-ED 8. في هذا البروتوكول، ونحن تهدف إلى تحقيق ط) من خلال توفير الظروف المواتية لاستكمال عملية الهضم DNA والثاني) من قبل خالب إدراج المعدن وحلول المعالجة خالب وكاشف عزل DNA الخاص، في حين أن الثالث) كانت موجهة جزئيا فقط إدراج الضوابط الإيجابية، وبالتالي تنص على أن الأسلوب هو قادر على اكتشاف 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية. مزيد من التأكيد هو أبعد من نطاق هذه الورقة. ومع ذلك، فإننا واثقون من أن هذا البروتوكول سوف تساعد المحتملينالمستخدمين على تحديد المدى الذي يحتاجون إليه للتحقق من صحة رسميا البروتوكول، حسب أغراضها. وهناك قائمة من الخطوات المطلوبة للمصادقة رسمية من طريقة أخرى. خلال تطوير ونشر طريقة للكشف عن 8 أوكسو dGuo، تم استعراض أساليب نشر وتوحيدها. وبالتالي، فإن هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى جمع المعلومات من عدة مصادر منشورة التي تفتقر في كثير من الأحيان تفاصيل التجريبية مهمة بينما توفر أيضا وسيلة سريعة ومباشرة من اختبار إذا تم اعتماد أسلوب للكشف وتقدير من 8 أوكسو dGuo بنجاح. كان يعمل هذا الأسلوب تكييفها لتحليل عينات من الحمض النووي بنجاح من الخلايا المستزرعة والأنسجة الفئران. هذه المقالة الفيديو سوف تساعد مجموعات أخرى في إنشاء وسيلة فعالة للكشف عن موثوقة وتقدير من 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-oxo-dGuo standard</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>89320</td>
			<td>Inappropriately referred to as &#34;8-hydroxy-2&#39;-deoxy Guanosine&#34; - see Fig. 1 and text for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5931</td>
			<td>From E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Chelates heavy metals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desferoxamine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGuo standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA from salmon sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td>Sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>TypeII, from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10503-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td>The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-K media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guard column</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 0204GC</td>
			<td>Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphodiesterase I enzyme&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3243</td>
			<td>Type II from Crotalus adamaneus venom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively</td>
			<td>Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YMC-BASIC column with bonded spherical silica</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 1546WT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues

ويرتبط الاكسدة مع العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، وكذلك التمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا، مما يؤدي إلى أكسدة الجزيئات الكبيرة، بما في ذلك الحمض النووي. ولذلك، كشف الفعال للأكسدة الحمض النووي مهم لمجموعة متنوعة من التخصصات البحثية، بما في ذلك الأدوية والسموم. A العلامات البيولوجية المشتركة للأضرار الحمض النووي oxidatively هو 8-أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2&#39;-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo، غالبا ما يشار إليها باسم خطأ 8-هيدروكسي-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo أو 8 -oxo-DG)). وقد وصفت عدة بروتوكولات لقياس 8 أوكسو dGuo ارتفاع ضغط اللوني السائل مع كشف الكهروكيميائية (HPLC-ED). ومع ذلك، طبقت هذه أساسا لDNA تنقية تعامل مع الموالية للتأكسد. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الاختلافات المنهجية بين المختبرات، ويرجع ذلك أساسا إلى الاختلافات في المعدات التحليلية، واعتماد أساليب نشرت للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED يتطلب التحسين دقيق من قبل كل مختبر. Aبروتوكول شامل، واصفا مثل هذه العملية الأمثل، غير متوفرة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية. فإنه يوضح كيفية إعداد عينة من الحمض النووي يمكن بسهولة وبسرعة الأمثل لتقليل أكسدة الحمض النووي غير المرغوب فيها التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات. ويظهر هذا البروتوكول كيفية اكتشاف 8 أوكسو dGuo في الخلايا المستزرعة الإنسان غدية السنخية (أي الخلايا A549) تعامل مع عامل مؤكسد KBrO 3، ومن الطحال من الفئران المعرضة للثنائي بنزو الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (صفر، ع) chrysene (DBC، المعروف سابقا باسم بنزو (أ، ل) بيرين، DalP). عموما، يوضح هذا العمل كيف منهجية HPLC-ED يمكن أن يكون الأمثل بسهولة للكشف عن 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية.

ولوحظ dGuo أن يكون لها الوقت الاحتفاظ 4.7 دقيقة في حين كان 8 أوكسو dGuo فترة الاحتفاظ حوالي 6.4 دقيقة (الشكل 2A وباء). هناك اختلاف حول 1000 أضعاف في مرتفعات الذروة بين التحاليل اثنين، كما يظهر في الشكل 2C. تم الحصول على Voltammograms لمدة 8-أوكسو dGuo وdGuo وفقا للمعايير الت...

Watch this Scientific Journal Video about HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2Ã¢â‚¬â„¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues at JoVE.com

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

والهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن الحمض النووي الأكسدة علامة، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2&#39;-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo) من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية.

HPLC قياس الحمض النووي الأكسدة العلامات البيولوجية، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2&#39;-deoxyguanosine، في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

ثابت للدولة، قبل المطرد للدولة، واحدة دوران قياس الحركية للنشاط الحمض النووي Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

للطي وتوصيف روبوت الحيوية استجابة من الحمض النووي اوريغامي

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

بناء نماذج التنبؤ تدميري من مكونات المحتويات في العنب البري بواسطة التحليل الطيفي القريبة من الأشعة تحت الحمراء بناء على قياسات HPLC

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

القائم HPLC الفحص لمراقبة خارج الخلية النكليوتيد / نوكليوزيد الأيض في خلايا سرطان الدم الليمفاوي المزمن الإنسان

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

تحديد التركيب الكيميائي لالمانع للتآكل واجهات / المعادن مع XPS: التقليل المشاركة الغمر الأكسدة

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

تصنيع واختبار الحرارة الضوئية

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

قياس واحد من HDAC1 والنشاط HDAC6 في الحلة الخلايا باستخدام أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط التحليل بتشتت الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

مقدر ألياف الاراميد كوبوليمر قوة عالية لتمكين تحديد خواصها الميكانيكية

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...