Name: hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2Ã¢â‚¬â„¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues at JoVE.com

Cette recherche a été financée par l&#39;Initiative de Santé Canada de recherche en génomique et le développement (GRDI) et la Stratégie canadienne de réglementation de la biotechnologie (SCRB). Les auteurs ne sont pas de conflit d&#39;intérêts.

Veiller à ce que tous l&#39;élevage, le logement, la manipulation et l&#39;expérimentation respecter les règles et réglementations locales et que les protocoles d&#39;expérimentation sont approuvés avant le début de toute étude. Pour les expériences décrites, soins aux animaux, la manipulation et le traitement ont été approuvés par le Comité de protection des animaux Santé Canada. Voir la &quot;table des réactifs&quot; pour l&#39;information des fournisseurs. 1. Prélèvement ...

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	<li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+oxidation+matters:+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine.">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-hydroxy-2'+-deoxyguanosine+(8-OHdG):+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis.">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li><li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage:+formation,+measurement,+and+biochemical+features.">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li><li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer:+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature.">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li><li>Culp, S. 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T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine:+implications+for+mutagenicity+and+repair.">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li><li>Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+(8-oxo-dGuo)+by+PAH+o-quinones:+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper(ii)/copper(i)+redox+cycling.">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li><li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress.">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li><li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+background+level+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine:+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up.">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li><li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice:+A+model+for+studying+mutations+in+vivo.">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li><li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+DNA+damage+is+associated+with+intense+noise+exposure+in+the+rat.">Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat.</a> Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).</li><li>European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+DNA+oxidation+in+human+cells+by+chromatographic+and+enzymic+methods.">Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods.</a> Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).</li><li>Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+and+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid.">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li><li>Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection:+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay.">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li><li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress.">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li><li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation.">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li><li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+urinary+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA.">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li><li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonising+measurements+of+8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine.">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA.">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAzol:+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA.">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li><li>Collins, A. R., Cadet, J., M&#246;ller, L., Poulsen, H. E., Vi&#241;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7,8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells.">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li><li>Badouard, C., M&#233;n&#233;zo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm.">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+DNA:+formation,+measurement+and+biochemical+features.">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).</li></ol>

Bien que 8-oxo-dGuo a été rapporté comme un biomarqueur utile de l&#39;oxydation de l&#39;ADN, sa quantification fiable peut représenter un défi. Bien que plusieurs méthodes publiées existent, il ya une nécessité d&#39;une approche globale, aperçu descriptif du protocole pour permettre aux chercheurs de déployer la méthode dans leurs laboratoires. Ici, nous présentons un aperçu détaillé d&#39;un protocole fondé HPLC-qui ​​permettra aux nouveaux utilisateurs d&#39;établir une méthode efficace pour ...

Espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS), dont les niveaux de l&#39;état d&#39;équilibre peut augmenter pendant de nombreuses conditions pathologiques et le métabolisme xenotoxic, contribuent à une augmentation de la fréquence des dommages oxydatifs à l&#39;ADN. Parmi plusieurs produits d&#39;oxydation possibles de nucléobases, des dommages oxydatifs de l&#39;ADN peut être facilement mesurée en utilisant le marqueur stable 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo), qui est l&#39;une des formes oxydées de 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo ADN est le plus abondant lésion 2 et, par conséquent, a été étudiée de façon plus détaillée en tant que biomarqueur de l&#39;oxydation de l&#39;ADN malgré l&#39;existence de produits d&#39;oxydation de l&#39;ADN multiple 3. Chez l&#39;homme, ces dommages peuvent être réparé via la base réparation par excision de 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Si laissé non réparés, 8-oxo-dGuo peut contribuer à la formation de base de mutations paire de substitution (ie, G à T transversions) 4. Fait important, la 8-oxo-dGuo est un marqueur établi for dommages à l&#39;ADN par rapport à l&#39;initiation et à la promotion de la cancérogenèse 2. Par conséquent, la quantification précise de la 8-oxo-dGuo est un biomarqueur utile et souhaitable de dommages oxydatifs de l&#39;ADN 5. Il ya une grande confusion dans la littérature concernant les noms corrects pour les formes oxydante endommagées de 2-désoxyguanosine et, d&#39;ailleurs, le nom correct du composé (s) régulièrement mesurés en tant que biomarqueur de lésions oxydatives de l&#39;ADN 6. Les 8-céto-6,8-dicéto-énol et 6, les formes tautomères des 8-oxo-dGuo (représenté sur la figure 1) sont les deux plus importants tautomères décrits dans la littérature 5,7. La forme 6,8-dicéto est la forme la plus importante au pH physiologique de 7,4, et est le produit d&#39;oxydation de l&#39;ADN le plus important 7. Par conséquent, 8-oxo-dGuo, plutôt que 8-hydroxy-dGuo est le nom le plus approprié pour ce produit d&#39;oxydation 6. Il est également important de noter que le 2-désoxyguanosine (dGuo), plutôt que nucleobase guanine (GUA) ribonucléoside ou guanosine (Guo), respectivement, sont détectés par la plupart des méthodes 6. Détection précise et la quantification de 8-oxo-dGuo est difficile en raison de: i) la variabilité dans la digestion de l&#39;échantillon d&#39;ADN, ii) l&#39;oxydation accidentelle de dGuo à 8-oxo-dGuo qui peut se produire lors de la préparation de l&#39;échantillon, et iii) la nécessité pour la validation effective de la méthode HPLC-ED analytique 8. Dans ce protocole, nous avons cherché à obtenir i) en fournissant des conditions, favorables à la digestion complète de l&#39;ADN et ii) par le chélateur inclusion de métal et des solutions de chélateur-traitée et un réactif d&#39;ADN isolation spéciale, tandis que iii) n&#39;a été que partiellement abordées par l&#39;inclusion de Des témoins positifs et fournissent ainsi que la méthode est capable de détecter des 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques. En outre la validation est au-delà de la portée de ce document. Cependant, nous sommes convaincus que ce protocole aidera la prospectiveles utilisateurs à déterminer la mesure dans laquelle ils ont besoin de valider formellement le protocole, en fonction de leurs besoins. Une liste des étapes nécessaires à la validation formelle de la méthode est fournie plus loin. Pendant le développement et le déploiement d&#39;une méthode de détection 8-oxo-dGuo, méthodes publiées ont été revues et consolidées. Ainsi, cette méthode élimine le besoin de recueillir des informations de plusieurs sources publiées qui manquent souvent d&#39;importants détails expérimentaux tout en fournissant également des moyens rapides et simples de tester si la méthode pour la détection et la quantification de 8-oxo-dGuo a été adoptée avec succès. Ce procédé a été adapté avec succès utilisé pour analyser des échantillons d&#39;ADN à partir de cellules en culture et le tissu murin. Cet article vidéo aidera les autres groupes à établir une méthode efficace pour la détection et la quantification fiable de 8-oxo-dGuo par HPLC-ED.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-oxo-dGuo standard</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>89320</td>
			<td>Inappropriately referred to as &#34;8-hydroxy-2&#39;-deoxy Guanosine&#34; - see Fig. 1 and text for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5931</td>
			<td>From E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Chelates heavy metals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desferoxamine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGuo standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA from salmon sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td>Sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>TypeII, from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10503-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td>The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-K media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guard column</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 0204GC</td>
			<td>Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphodiesterase I enzyme&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3243</td>
			<td>Type II from Crotalus adamaneus venom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively</td>
			<td>Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YMC-BASIC column with bonded spherical silica</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 1546WT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues

Le stress oxydatif est associé à de nombreux processus physiologiques et pathologiques, ainsi que le métabolisme des xénobiotiques, conduisant à l&#39;oxydation des macromolécules biologiques, y compris l&#39;ADN. Par conséquent, la détection efficace de l&#39;oxydation de l&#39;ADN est important pour une variété de disciplines de recherche, y compris la médecine et de la toxicologie. Un biomarqueur commun par oxydation de l&#39;ADN endommagé est le 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo; souvent appelée à tort comme 8-hydroxy-2&#39;-désoxyguanosine (8-OH-dGuo ou 8 oxo-dG)). Plusieurs protocoles de mesure 8-oxo-dGuo par chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique (HPLC-ED) ont été décrites. Toutefois, ceux-ci ont été principalement appliquées à l&#39;ADN purifié traité avec pro-oxydants. En outre, en raison de différences méthodologiques entre les laboratoires, principalement en raison de différences dans l&#39;équipement analytique, l&#39;adoption de méthodes publiées pour la détection de la 8-oxo-dGuo par HPLC-ED nécessite une optimisation soignée par chaque laboratoire. UNprotocole complet, décrivant un tel processus d&#39;optimisation, est absente. Ici, un protocole détaillé est décrit pour la détection de 8-oxo-dGuo par HPLC-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux. Elle illustre comment la préparation d&#39;échantillons d&#39;ADN peut être facilement et rapidement optimisée pour minimiser l&#39;oxydation indésirable de l&#39;ADN qui peut se produire au cours de la préparation des échantillons. Ce protocole montre comment détecter 8-oxo-dGuo dans des cellules humaines en culture d&#39;adénocarcinome alvéolaire (par exemple, des cellules A549) traités avec l&#39;agent oxydant KBrO 3, et à partir de la rate des souris exposées à la dibenzo d&#39;hydrocarbure aromatique polycyclique (DEF, p) chrysène (DBC, anciennement connu sous le dibenzo (a, l) pyrène, Dalp). Dans l&#39;ensemble, ce travail illustre comment une méthode HPLC-ED peut être facilement optimisée pour la détection de la 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques.

dGuo a été observé à un temps de rétention de 4,7 min alors que les 8-oxo-dGuo avait un temps de rétention d&#39;environ 6,4 min (Figure 2A et B). Il n&#39;y a de différence sur 1000 fois dans les hauteurs de pics entre les deux analytes, comme on le voit sur ​​la figure 2C. Voltammogrammes pour 8-oxo-dGuo et dGuo ont été obtenus par les normes en cours d&#39;exécution à un potentiel de travail dans la gamme de 0,2 à 1,1 V. Le potentiel de travail optima...

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HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Le but de ce protocole est la détection du marqueur de l&#39;oxydation de l&#39;ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo) par CLHP-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux.

HPLC: Mesure de l&#39;oxydation des biomarqueurs ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine, dans des cellules cultivées et des tissus animaux

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

L&#39;état d&#39;équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d&#39;affaires de l&#39;activité de ADNglycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Recherche

Chimie

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Pliant et caractérisation d&#39;un Robot Bio-sensible de l&#39;ADN Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Construction de modèles de prédiction non destructive des matières Ingrédient en Blueberries par spectroscopie proche infrarouge basée sur des mesures de CLHP

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthèse des bioconjugués protéiques<em&gt; via</em&gt; Cystéine-maléimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

Détermination de la composition chimique de corrosion Inhibiteur Interfaces / métal avec XPS: Minimiser Poster Immersion Oxydation

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Fabrication et essai de thermomètres photoniques

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Mesure simultanée de HDAC1 et de HDAC6 activité en HeLa cellules utilisant UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Démêler les fibres d’aramide de copolymère haute résistance afin de permettre la détermination de leurs propriétés mécaniques

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...