Name: hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2Ã¢â‚¬â„¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo Canadá Health Initiative Genomics Research e Desenvolvimento (GRDI) ea Estratégia Regulatória Canadense de Biotecnologia (RCSB). Os autores não têm qualquer conflito de interesses.

Certifique-se de que todos pecuária, acomodação, manuseamento e experimentação aderir às regras e regulamentos locais e que os protocolos de experimentação sejam aprovadas antes de iniciar qualquer estudo. Para as experiências descritas, cuidados animais, manipulação e tratamento foram aprovados pelo Comitê Animal Care a Health Canada. Consulte a &quot;Tabela de Reagentes&quot; para obter informações dos fornecedores. 1. Coleta de Amostras Biológicas <ol><li> As células ou ...

<ol>
	<li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+oxidation+matters:+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine.">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-hydroxy-2'+-deoxyguanosine+(8-OHdG):+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis.">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li><li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage:+formation,+measurement,+and+biochemical+features.">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li><li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer:+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature.">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li><li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li><li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., M&#248;ller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA.">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li><li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine:+implications+for+mutagenicity+and+repair.">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li><li>Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+(8-oxo-dGuo)+by+PAH+o-quinones:+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper(ii)/copper(i)+redox+cycling.">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li><li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress.">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li><li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+background+level+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine:+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up.">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li><li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice:+A+model+for+studying+mutations+in+vivo.">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li><li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+DNA+damage+is+associated+with+intense+noise+exposure+in+the+rat.">Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat.</a> Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).</li><li>European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+DNA+oxidation+in+human+cells+by+chromatographic+and+enzymic+methods.">Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods.</a> Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).</li><li>Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+and+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid.">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li><li>Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection:+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay.">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li><li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress.">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li><li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation.">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li><li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+urinary+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA.">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li><li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonising+measurements+of+8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine.">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA.">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAzol:+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA.">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li><li>Collins, A. R., Cadet, J., M&#246;ller, L., Poulsen, H. E., Vi&#241;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7,8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells.">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li><li>Badouard, C., M&#233;n&#233;zo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm.">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+DNA:+formation,+measurement+and+biochemical+features.">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).</li></ol>

Apesar de 8-oxo-dGuo foi classificado como um biomarcador útil de oxidação do DNA, a sua quantificação confiável pode representar um desafio. Embora existam vários métodos publicados, há uma necessidade de uma visão abrangente, descritivo de protocolo para permitir que pesquisadores para implantar o método em seus laboratórios. Aqui apresentamos uma visão detalhada de um protocolo baseado em HPLC que irá permitir novos usuários para estabelecer um método eficaz para a detecção e quantificação de 8-ox...

Espécies reativas de oxigênio (ROS), cujos níveis de estado estacionário pode aumentar durante muitas condições patológicas e metabolismo xenotoxic, contribuir para um aumento da frequência de dano oxidativo ao DNA. Entre os vários possíveis nucleobases produtos de oxidação, lesões oxidativas do ADN pode ser facilmente medida utilizando o marcador estável de 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo), que é uma das formas oxidadas de 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo é o mais abundante lesão de DNA 2 e, por conseguinte, foi estudada a maior detalhe como um biomarcador oxidação DNA, apesar da existência de múltiplos produtos de oxidação de ADN 3. Nos seres humanos, este dano pode ser reparado através de base de reparo de excisão por 8-oxoguanine glicosilase 1 (hOGG1) 4. Se reparado, 8-oxo-dGuo pode contribuir para a formação da base de mutações de substituição de par (isto é, transversões de G para T) 4. Importante, 8-oxo-dGuo é um marcador estabelecido fodano do ADN r em relação à iniciação e promoção da carcinogénese 2. Portanto, a quantificação precisa de 8-oxo-dGuo é um biomarcador útil e desejável de dano oxidativo ADN 5. Há uma confusão generalizada na literatura sobre os nomes corretos para as formas oxidativamente-danificadas do 2-desoxiguanosina e, além disso, o nome correto do composto (s) medidos rotineiramente como um biomarcador de dano oxidativo DNA 6. Os 6,8-diceto-enol e 6, 8-ceto formas tautoméricas de 8-oxo-dGuo (mostrado na Figura 1) são os dois tautómeros mais proeminentes discutidos na literatura 5,7. A forma de ácido 6,8-diceto é a forma mais proeminente a pH fisiológico de 7,4, e é o mais proeminente do produto de oxidação de DNA 7. Portanto, 8-oxo-dGuo, em vez de 8-hidroxi-dGuo é o nome mais adequado para este produto de oxidação 6. É também importante notar que a 2-desoxiguanosina (dGuo), em vez de nucleobase guanina (Gua) ou guanosina ribonucleósido (Guo), respectivamente, é detectado pela maioria dos métodos 6. Detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo preciso é um desafio devido a: i) a variabilidade na digestão da amostra de ADN, ii) oxidação acidental de dGuo a 8-oxo-dGuo que pode ocorrer durante a preparação da amostra, e iii) a necessidade eficaz para validação do método de HPLC analítico ED-8. Neste protocolo, com vista à consecução i) proporcionando condições favoráveis, para a digestão completa do ADN e ii) pela inclusão quelante de metal e soluções tratados com quelantes e um reagente especial de isolamento de DNA, enquanto iii) foi apenas parcialmente abordados pela inclusão de controlos positivos e proporcionando, assim, que o método é capaz de detectar 8-oxo-dGuo em amostras biológicas. Além disso validação está além do escopo deste artigo. No entanto, estamos confiantes de que este protocolo vai ajudar o prospectivoutilizadores determinar a extensão em que eles precisam validar formalmente o protocolo, dependendo das suas finalidades. Uma lista dos passos requeridos para a validação formal do método é ainda proporcionado. Durante o desenvolvimento e implantação de um método de detecção 8-oxo-dGuo, métodos publicados foram revistos e consolidados. Assim, este método elimina a necessidade de recolher informações a partir de várias fontes publicadas que carecem frequentemente importantes detalhes experimentais ao mesmo tempo proporcionar meios rápidos e simples de testar se o método para a detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo foi adoptada com sucesso. Este método foi adaptado empregue com sucesso para analisar amostras de ADN a partir de células cultivadas e tecidos de murino. Este artigo de vídeo ajudará outros grupos no estabelecimento de um método eficaz para a detecção e quantificação fiável de 8-oxo-dGuo por CLER-ED.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-oxo-dGuo standard</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>89320</td>
			<td>Inappropriately referred to as &#34;8-hydroxy-2&#39;-deoxy Guanosine&#34; - see Fig. 1 and text for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5931</td>
			<td>From E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Chelates heavy metals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desferoxamine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGuo standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA from salmon sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td>Sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>TypeII, from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10503-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td>The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-K media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guard column</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 0204GC</td>
			<td>Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphodiesterase I enzyme&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3243</td>
			<td>Type II from Crotalus adamaneus venom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively</td>
			<td>Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YMC-BASIC column with bonded spherical silica</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 1546WT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues

O stress oxidativo está associado a diversos processos fisiológicos e patológicos, assim como o metabolismo xenobiótico, levando a oxidação de biomacromoléculas, incluindo ADN. Portanto, a detecção eficiente de oxidação do DNA é importante para uma variedade de disciplinas de investigação, incluindo a medicina e toxicologia. Um biomarcador comum de ADN é danificado oxidativamente 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo; erroneamente frequentemente referido como 8-hidroxi-2&#39;-desoxiguanosina (8-OH-dGuo ou 8 -oxo-dG)). Vários protocolos de medição 8-oxo-dGuo por cromatografia líquida de alta pressão com detecção electroquímica (HPLC-ED) foram descritos. No entanto, estas foram principalmente aplicada a ADN purificado tratados com pró-oxidantes. Além disso, devido a diferenças metodológicas entre laboratórios, principalmente devido às diferenças de equipamento analítico, a adoção de métodos publicados para a detecção de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED requer otimização cuidadosa de cada laboratório. UMAprotocolo abrangente, que descreve este processo de otimização, é inexistente. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para a detecção de 8-oxo-dGuo por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais. Ele ilustra como a preparação da amostra de ADN podem ser facilmente e rapidamente optimizada para minimizar a oxidação do ADN indesejáveis ​​que podem ocorrer durante a preparação da amostra. Este protocolo demonstra como detectar 8-oxo-dGuo em células humanas cultivadas adenocarcinoma alveolar (isto é, células A549) tratadas com o agente oxidante KBrO 3, e a partir do baço de ratinhos expostos ao hidrocarboneto aromático policíclico dibenzo (DEF, p) criseno (DBC, anteriormente conhecido como dibenzo (a, l) pireno, DalP). Em geral, este trabalho ilustra como uma metodologia de CLER-ED pode ser facilmente optimizado para a detecção de 8-oxo-dGuo em amostras biológicas.

dGuo foi observado a ter um tempo de retenção de 4,7 minutos enquanto que 8-oxo-dGuo teve um tempo de retenção de aproximadamente 6,4 minutos (Figura 2A e B). Há uma diferença de cerca de 1.000 vezes em as alturas dos picos entre os dois analitos, como pode ser visto na Figura 2C. Voltamogramas de 8-oxo-dGuo e dGuo foram obtidos por padrões que funcionam a um potencial de trabalho na gama de 0,2-1,1 V. O potencial de trabalho óptima para o 8-oxo-dGuo foi determi...

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HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

O objectivo do presente protocolo é a detecção do marcador de oxidação do DNA, 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo) por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais.

A medição por HPLC do ADN Oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Química

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Dobragem e Caracterização de um Robô Bioresponsivo a partir de DNA Origami

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Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

-HPLC baseado Ensaio para monitorar Extracelular Nucleotide / nucleosídeos Metabolismo em crônicas células de leucemia linfocítica Humanos

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

Determinar a composição química do inibidor de corrosão / Metal Interfaces com XPS: Minimizando Pós Immersion Oxidação

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Fabricação e teste dos termómetros fotônicos

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Medição simultânea de HDAC1 e atividade HDAC6 em HeLa células usando UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

DNA-magnético partícula análise por dispersão de luz dinâmica e eletroforético de vinculação

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Desembaraçar as fibras de aramida de copolímero de alta resistência para permitir a determinação de suas propriedades mecânicas

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...