Name: hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2Ã¢â‚¬â„¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues at JoVE.com

Это исследование было профинансировано Канада геномики исследований и развития инициативы в области здравоохранения (GRDI) и Стратегии канадской регулированию в области биотехнологии (CRSB). Авторы не имеют конфликта интересов.

Убедитесь, что все животноводство, жилье, обработки и эксперименты в соответствии с местными нормами и правилами и что экспериментирование протоколы утверждаются до начала каких-либо исследование. Для описанных экспериментов, уход за животными, обработка и лечение были одобрены Коми?...

<ol>
	<li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+oxidation+matters:+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine.">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-hydroxy-2'+-deoxyguanosine+(8-OHdG):+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis.">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li><li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage:+formation,+measurement,+and+biochemical+features.">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li><li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer:+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature.">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li><li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li><li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., M&#248;ller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA.">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li><li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine:+implications+for+mutagenicity+and+repair.">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li><li>Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+(8-oxo-dGuo)+by+PAH+o-quinones:+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper(ii)/copper(i)+redox+cycling.">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li><li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress.">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li><li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+background+level+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine:+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up.">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li><li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice:+A+model+for+studying+mutations+in+vivo.">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li><li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+DNA+damage+is+associated+with+intense+noise+exposure+in+the+rat.">Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat.</a> Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).</li><li>European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+DNA+oxidation+in+human+cells+by+chromatographic+and+enzymic+methods.">Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods.</a> Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).</li><li>Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+and+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid.">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li><li>Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection:+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay.">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li><li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress.">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li><li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation.">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li><li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+urinary+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA.">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li><li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonising+measurements+of+8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine.">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA.">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAzol:+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA.">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li><li>Collins, A. R., Cadet, J., M&#246;ller, L., Poulsen, H. E., Vi&#241;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7,8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells.">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li><li>Badouard, C., M&#233;n&#233;zo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm.">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+DNA:+formation,+measurement+and+biochemical+features.">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).</li></ol>

Хотя 8-оксо-dGuo сообщалось полезным биомаркеров окисления ДНК, его надежность количественное может создать проблему. Хотя существует несколько опубликованных методов, есть необходимость всеобъемлющего, описательной обзор протокола, чтобы позволить исследователям развернуть метод в ?...

Активные формы кислорода (АФК), чьи стационарное уровни могут увеличить в течение многих патологических состояний и xenotoxic метаболизма, способствует увеличению частоты окислительного повреждения ДНК. Среди нескольких возможных нуклеотидных продуктов окисления, окислительного повреждения ДНК легко может быть измерена с помощью стабильного маркер 8-оксо-7,8-дигидро-2&#39;-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo), который является одним из окисленных форм 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-оксо-dGuo является наиболее распространенным поражение DNA 2, и, следовательно, был изучен более подробно в качестве биомаркера окисления ДНК, несмотря на существование нескольких продуктов окисления ДНК 3. В людях, это повреждение можно отремонтировать с помощью базовой ремонта вырезания на 8-оксогуанин гликозилазы 1 (hOGG1) 4. Если осталось без ремонта, 8-оксо-dGuo может способствовать формированию базовых мутаций пара-замещение (т.е. е к т трансверсии) 4. Важно отметить, что 8-оксо-dGuo является установленным маркером FOг повреждение ДНК в отношении установления и развития канцерогенеза 2. Таким образом, точное определение количества 8-оксо-dGuo является полезным и желательным биомаркер окислительного повреждения ДНК 5. Существует распространенное заблуждение в литературе о правильных названий окислительно-поврежденных форм 2-дезоксигуанозина и, кроме того, правильное название соединения (ий) обычно измеряется в качестве биомаркеров окислительного повреждения ДНК 6. В 6,8-дикето и 6-енольные, 8-кето таутомерные формы 8-оксо-dGuo (показано на рисунке 1) являются двумя наиболее видные таутомерам, обсуждаемые в литературе 5,7. Форма 6,8-дикето является наиболее заметной формой при физиологическом рН 7,4, и наиболее заметным продуктом окисления ДНК 7. Таким образом, 8-оксо-dGuo, а не 8-гидрокси-dGuo является наиболее подходящее название для этого продукта окисления 6. Важно также отметить, что 2-дезоксигуанозин (dGuo), а не nucleobаза гуанин (гуа) или рибонуклеозид гуанозин (Го), соответственно, обнаружена в большинстве методов 6. Точное обнаружение и количественное определение 8-оксо-dGuo является сложной задачей из-за: я) изменчивости в переваривании образца ДНК, II) случайный окисление dGuo 8-оксо-dGuo, которые могут возникнуть во время подготовки образца, и III) необходимость для эффективного проверки результаты анализа методом ВЭЖХ-ЭД 8. В этом протоколе, мы нацелены на достижение I), обеспечивая условия, благоприятные для полного переваривания ДНК и б) путем включения хелатор металла и хелаторных обработанных растворов и специального ДНК-выделении реагента, а III) был только частично решены путем включения Положительные контроли и, таким образом, обеспечивая, что метод способен обнаруживать 8-оксо-dGuo в биологических образцах. Кроме того проверка выходит за рамки данной статьи. Тем не менее, мы уверены, что этот протокол поможет перспективнымпользователи определяют степень, до которой они должны формально подтвердить протокол, в зависимости от их целей. Перечень шагов, необходимых для формального проверки метода обеспечивается дальше. В ходе разработки и развертывания метода для обнаружения 8-оксо-dGuo, опубликованных методов были рассмотрены и консолидированы. Таким образом, этот метод устраняет необходимость сбора информации из нескольких опубликованных источников, которые зачастую не имеют важные экспериментальные детали, а также предоставляет быстрый и простые средства тестирования, если метод обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo успешно принят. Это адаптировать метод был использован для успешного анализа образцов ДНК из культивируемых клеток мышиной и ткани. Это видео статья поможет другим группам в создании эффективного способа для надежного обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo по ВЭЖХ-ЭД.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-oxo-dGuo standard</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>89320</td>
			<td>Inappropriately referred to as &#34;8-hydroxy-2&#39;-deoxy Guanosine&#34; - see Fig. 1 and text for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5931</td>
			<td>From E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Chelates heavy metals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desferoxamine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGuo standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA from salmon sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td>Sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>TypeII, from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10503-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td>The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-K media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guard column</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 0204GC</td>
			<td>Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphodiesterase I enzyme&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3243</td>
			<td>Type II from Crotalus adamaneus venom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively</td>
			<td>Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YMC-BASIC column with bonded spherical silica</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 1546WT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues

Оксидативный стресс, связанный с многих физиологических и патологических процессов, а также метаболизма ксенобиотиков, приводит к окислению биомакромолекул, в том числе ДНК. Таким образом, эффективность обнаружения окисления ДНК важно для различных исследовательских дисциплин, в том числе медицины и токсикологии. Общий биомаркер окислительного поврежденной ДНК является 8-оксо-7,8-дигидро-2&#39;-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo; часто ошибочно называют 8-гидрокси-2&#39;-дезоксигуанозин (8-OH-dGuo или 8 оксо-DG)). Несколько протоколов для 8-оксо-dGuo измерения методом жидкостной хроматографии под высоким давлением с электрохимическим детектированием (ВЭЖХ-ЭД) были описаны. Тем не менее, они были в основном применяется для очищенной ДНК, обработанной прооксидантов. Кроме того, из-за методологических различий между лабораториями, в основном из-за различий в аналитическом оборудовании, принятие опубликованных методов обнаружения 8-оксо-dGuo по ВЭЖХ-ЭД требуется тщательная оптимизация по каждой лаборатории.комплексный протокол, описывая такой процесс оптимизации, не хватает. Здесь Подробный протокол описан для обнаружения 8-оксо-dGuo с помощью ВЭЖХ-ЭД, в ДНК из культивируемых клеток или тканей животных. Это показывает, как подготовка проб ДНК может быть легко и быстро оптимизированы, чтобы свести к минимуму нежелательное окисление ДНК, которые могут возникнуть при подготовке пробы. Этот протокол показывает, как определить 8-оксо-dGuo в культивированных человеческих клеток аденокарциномы альвеолярного (т.е. клетки А549), обработанные с окислителем KBrO 3, и из селезенки мышей, подвергнутых воздействию полициклических ароматических углеводородов дибензо (DEF, р) хризена (DBC, ранее известный как дибензо (, л) пирена, DalP). В целом, эта работа показывает, как методика ВЭЖХ-ЭД может быть легко оптимизирована для обнаружения 8-оксо-dGuo в биологических образцах.

dGuo наблюдалось иметь время удерживания 4,7 мин, тогда как 8-оксо-dGuo имел врем удерживани приблизительно 6,4 минут (фиг.2А и Б). Существует около 1000-кратное различие в пиковых высот между двумя аналитов, как видно на фиг.2С. Вольтамперограммах для 8-оксо-dGuo и dGuo были п...

Watch this Scientific Journal Video about HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2Ã¢â‚¬â„¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues at JoVE.com

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Целью этого протокола является определение степени окисления ДНК-маркера, 8-оксо-7,8-дигидро-2&#39;-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo) с помощью ВЭЖХ-ЭД, в ДНК из культивируемых клеток или тканей животных.

ВЭЖХ Измерение ДНК окисления биомаркер, 8-оксо-7,8-дигидро-2&#39;-дезоксигуанозин, в культивируемых клетках и тканях животных

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Стационарная, Pre-стационарная, и односпальная кровать-оборота кинетические измерения активности ДНК гликозилаза

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Складной и характеристика Био-отзывчивого робота от ДНК оригами

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Построение моделей для прогнозирования неразрушающему ингредиента Содержание в чернике с помощью ближней инфракрасной спектроскопии на основе ВЭЖХ измерений

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

ВЭЖХ на основе анализа для мониторинга внеклеточного нуклеотидную / нуклеозид Метаболизм в человека хронический лимфолейкоз клеток

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

Определение химического состава ингибитора коррозии / Metal Интерфейсы с XPS: Минимизация Сообщение Погружение Окисление

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Изготовление и испытание фотонные Термометры

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Одновременное измерение HDAC1 и HDAC6 активности в НеЬа клетки с помощью UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

ДНК-магнитопорошковый обязательного анализа динамических и электрофоретической рассеяние света

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Распутывание сополимер высокопрочных арамидных волокон чтобы включить определение их механических свойств

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...