Name: bone conditioned medium: preparation and bioassay
Uploaded: 2015-07-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay at JoVE.com

Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.

1. BCM Framställning <ol><li> Skaffa gris mandibles från den lokala slaktaren så färsk som möjligt. Placera mandibles till fast underlag och släppa en full tjocklek klaff särskild uppmärksamhet att inte lämna någon mjuk vävnad eller periosthärstammande fäst vid benet. Arbeta i en ren miljö utan att behöva arbeta under flöde huva. </li><li> När en full tjocklek flik släpps, använder ett ben skrapa för att skörda benbitar från den buckala sidan. Observera att benet skrapan måste vara skarp. Handta...

<ol>
	<li>Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Stability+of+Early+Implant+Placement+with+Contour+Augmentation.">Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation.</a> Journal of dental research. , (2013).</li><li>Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=augmentation+procedures+in+implant+dentistry.">augmentation procedures in implant dentistry.</a> The International journal of oral &amp; maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).</li><li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=substitutes:+an+update.+Injury.">substitutes: an update. Injury.</a> 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).</li><li>Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=healing+and+graft+resorption+of+autograft,+anorganic+bovine+bone+and+beta-tricalcium+phosphate.+A+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs.">healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).</li><li>Jensen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+biphasic+calcium+phosphate+in+standardized+bone+defects:+a+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs.">Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).</li><li>Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=graft+and+bone+graft+substitutes+in+spine+surgery:+current+concepts+and+controversies.">graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).</li><li>Khan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+bone+grafting.">The biology of bone grafting.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).</li><li>Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteogenic+effect+of+bone+transplants+in+rabbits.+The+Journal+of+bone+and+joint+surgery.">The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery.</a> British. 50, 866-873 (1968).</li><li>Bone Urist, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=formation+by+autoinduction.">formation by autoinduction.</a> Science. 150, 893-899 (1965).</li><li>Caball&#233;-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+porcine+bone+conditioned+medium.">Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium.</a> The International journal of oral &amp; maxillofacial implants. , (2014).</li><li>Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-Conditioned+Medium+Inhibits+Osteogenic+and+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Cells+In+Vitro.">Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro.</a> Clinical implant dentistry and related research. , (2014).</li><li>Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+chips+release+of+sclerostin+and+FGF-23+into+the+culture+medium:+an+in+vitro+pilot+study.">Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study.</a> Clinical oral implants research. , (2014).</li><li>Caball&#233;-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=conditioned+medium+enhances+osteoclastogenesis+in+murine+bone+marrow+cultures.+Clin+Oral+Impl+Res;+in.">conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).</li><li>Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-conditioned+medium+changes+gene+expression+in+bone-derived+fibroblasts).">Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts).</a> IJOMI accepted. , (2014).</li><li>Fulzele, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelopoiesis+is+regulated+by+osteocytes+through+Gsalpha-dependent+signaling.">Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling.</a> Blood. 121, 930-939 (2013).</li><li>Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demineralized+bone+matrix+mediates+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+in+vitro:+effect+of+age+of+cell+donor.">Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor.</a> Journal of. 11, 1703-1714 (1996).</li><li>Kupcova Skalnikova, ., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+techniques+for+characterisation+of+mesenchymal+stem+cell+secretome.">Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome.</a> Biochimie. , (2013).</li><li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cell+secretome:+A+novel+role+for+progranulin+during+risedronate+treatment.">Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment.</a> , (2013).</li><li>Schuldt Filho, ., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+of+demineralized+bone+matrix+activates+TGF-&#946;+signaling+pathways+in+mesenchymal+cells+in+vitro.">Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-&#946; signaling pathways in mesenchymal cells in vitro.</a> J Cranio Maxill Surg. , (2015).</li><li>Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+implant+placement+following+single-tooth+extraction+in+the+esthetic+zone:+biologic+rationale+and+surgical+procedures).">Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures).</a> The International journal of periodontics &amp; restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).</li><li>Stoecklin-Wasmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorbable+collagen+membranes+for+periodontal+regeneration:+a+systematic+review.">Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review.</a> Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).</li></ol>

Bone-konditionerat medium speglar släppt aktivitet bentransplantat under de tidiga stadierna av benuppbyggnad. Protokollet som beskrivs här kan anpassas för att studera svaret hos olika typer av celler som är involverade i benåterbildning. Vidare kan protokollet användas för att framställa konditionerat medium från bearbetade ben- eller skelettfyllmedel. Metoderna är lätta att utföra och förlita sig på ett enkelt koncept: de faktorer som frigörs från olika inhemska och bearbetat ben. Att förstå hur BCM...

Autolog ben används ofta för att överbrygga brister som uppstått till följd av missbildning, resektiv kirurgi, rekonstruktiv traumakirurgi, och innan implantatet 1,2. Förstå de biologiska principerna för hur benimplantat stödja konsolideringsprocessen transplantat är inte bara nyckeln till att förstå varför auto anses vara guldmyntfoten i rekonstruktiv kirurgi, är det också bionic för förbättrad utformning av bensubstitut 3. Ändå är konsolidering transplantat snabbare med autolog ben jämfört med ben ersätter 4,5. Sålunda är det absolut nödvändigt att avslöja de molekylära och cellulära mekanismer som gör autologt ben så effektiv för att stödja benregenerering. Det finns tre lärobok egenskaper hos auto som anses stödja konsolideringsprocessen 6,7. Först autolog ben är osteokonduktivt, ge vägledning för det nybildade benet att växai defekten. För det andra är autologt ben osteogen, vilket betyder att det innehåller mesenkymala celler som kan differentiera till osteoblaster 8. Tredje, autolog ben är osteoinduktiv som tillväxtfaktorer som benmorfogenetiska proteiner entombed i matrisen kan inleda processen av endokondral eller ens intramembranös benbildning 9. Det finns en annan aspekt: ​​nylagade benbitar hålla en parakrin funktion baserad på observationer in vitro med &quot;ben konditionerat medium&quot; 10-15. Även effekterna av myelopoes bör nämnas 16. En liknande termen &quot;demineraliserat benmatris-konditionerat medium&quot; var redan myntades 1996 och stöder det övergripande konceptet av en parakrin funktion av ben, även när de behandlas av demineralisering 17. För våra syften, kan BCM framställas av färsk svin mandibles 10,11. Proteomik analyser av BCM avslöjade komplex sammansättning, inklusive tillväxt faktumyttersta randområdena och beståndsdelar i den extracellulära matrisen 10, som sträcker sig även befintlig kunskap om proteasomet av hela ben 18,19. Sålunda bör BCM spegla den frisatta aktiviteten av olika modifikationer av bentransplantat in vitro. Vad händer när mesenkymala celler, till exempel sådana som isolerats från benbitar eller från oral mjukvävnad, utsätts för BCM? In vitro minskar BCM osteogen och adipogena differentiering, och framkallar en kraftig ökning av IL11 uttryck 11. Genome breda mikromatris avslöjade flera gener som skall differentiellt uttryckt i mesenkymala celler som svar på BCM. Bland dessa gener är adrenomeduUin (ADM), IL11, IL33, NADPH-oxidas 4 (NOX4), proteoglykan 4 (PRG4 eller lubricin) och pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM erhållits från autoklave benbitar inte ändra uttrycket av respektive gener 14. BCM från benbitar som genomgick pastörisering och frysning kundeändra genexpression 14. Också konditionerat medium av demineraliserat benmatris (DBM-CM) ändrar expressionen av TGF-β-reglerade gener 20. Intressant, kollagenbarriärmembran som används för att skydda de benbitar från den omgivande mjuka vävnaden 21,22, adsorberat de delar av BCM som är ansvariga för de förändringar i genuttryck 23. BCM forskning kan utvidgas till andra celltyper som är involverade i benuppbyggnad såsom benresorberande osteoklaster och endotelceller, för att nämna några. Sammantaget ackumulerande in vitro-data ger en vetenskaplig grund för utformningen av en preklinisk studie. Den nuvarande protokollet är tvåfaldigt: För det första visar det hur man förbereder BCM. För det andra visar det hur man testar sin biologiska aktivitet baserad på mesenkymala celler in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pig Mandibles</td>
			<td>Local bucher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Scraper</td>
			<td>Hu-Friedy</td>
			<td>PPBUSE2/36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics &#38; Antimicotics</td>
			<td>All life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Membranes (Bio-Gide)</td>
			<td>Geistlich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation</td>
			<td align="right">16030074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen Corporation</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			High Pure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">4379012001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green (for Q-RT-PCR)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">4673484001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone conditioned medium: preparation and bioassay

Autolog bentransplantat används ofta i muntlig och käkkirurgi, ortopedi och traumatologi. Autolog bentransplantat inte bara ersätta saknade ben, de stöder också den komplexa processen för benuppbyggnad. Denna positiva beteendet hos autotillskrivs de tre egenskaper: osteokonduktivitet, osteogenicity och osteoinduktivitet. Det finns emellertid en annan aspekt: ​​bone grafts släppa en myriad av molekyler, inklusive tillväxtfaktorer, vilka kan rikta mesenkymala celler som är involverade i benåterbildning. De parakrina egenskaper bentransplantat kan studeras in vitro genom användning av ben-konditionerat medium (BCM). Här presenterar vi ett protokoll om hur man förbereder ben konditionerat medium från inhemska gris kortikalt ben och ben som genomgick värmebehandling eller demineralisering. Celler kan direkt utsättas för BCM eller ympas på biomaterial, såsom kollagenmembran, tidigare indränkt med BCM. Vi ger exempel på in vitro bioassays med mesenkymala celler på uttrycket av TGF-β-reglerade gener. De presenterade protokoll bör uppmuntra till ytterligare avslöja parakrina effekterna av bentransplantat under benuppbyggnad och öppna en väg för translationell forskning inom det breda området rekonstruktiv kirurgi.

Bone medium framställs från färska svin benbitar. Allmän översikt av processen för framställning av BCM och att använda biomaterial i kombination med BCM visas i figur 1 och figur 2 respektive. Under BCM förberedelser, är det viktigt att få stora benbitar med långa rörelser som korta rörelser eller mycket små benbitar kan påverka kvaliteten på slut BCM. Kvalitet på BCM kan kontrolleras genom att analysera genuttrycket av BCM målgener: ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 och P...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay at JoVE.com

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Vi beskriver här hur man förbereder ben konditionerat medium (BCM) och testa dess aktivitet in vitro.

Bone medium: Förberedelse och bioanalys

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

Att upprätthålla Wolbachia i Cell-fri Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified Bone Förberedelse för histologi, Histomorphometry och fluorokrom Analys

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Vävnadsuppsamling och RNA-extraktion från den mänskliga osteoarthritiska knäleden

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Använda realtidscellmetabolisk flödesanalysator för att övervaka osteoblastbioenergetik

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

En förbättrad Chemotaxis-analys för snabb identifiering av Rhizobacterial Chemoattractants i Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

Aktuell applikationsbioassay för att kvantifiera insekticidtoxicitet för myggor och fruktflugor

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability

Caco-2-cellbioassay för mätning av biotillgänglighet för livsmedelsjärn

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is ...

An Improved Method to Measure Pollen Hydration Profiles in Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE 

En högupplöst, enkelkornig, in vivo pollenhydreringsbioassay för Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...