Name: isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.
Uploaded: 2015-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts. at JoVE.com

This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).

تمت الموافقة على الدراسات الفئران من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة نورث كارولينا تشابل هيل، وكان كل رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC. 1. إعداد الوليد والكبار التوتة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direc...

<ol>
	<li>Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+tolerance+by+clonal+elimination+in+the+thymus.">T cell tolerance by clonal elimination in the thymus.</a> Cell. 49 (2), 273-280 (1987).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).</li><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire:+what+thymocytes+see+(and+don&#8217;t+see).">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don&#8217;t see).</a> Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li><li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+immunologic+self-tolerance.">Acquisition of immunologic self-tolerance.</a> Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).</li><li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+central+tolerance+in+NOD+mice.">A defect in central tolerance in NOD mice.</a> Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).</li><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+central+tolerance+with+reaggregate+thymus+organ+cultures.">Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures.</a> Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).</li><li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+development+of+autoreactive+T+cells+in+NOD+mice+is+regulated+in+an+age-dependent+manner.">Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner.</a> J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).</li><li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.+Immunophenotyping.">Chapter 6. Immunophenotyping.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Rice, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+transplantation+for+complete+DiGeorge+syndrome:+medical+and+surgical+considerations.">Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations.</a> J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).</li><li>Markert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+thymus+tissue+in+complete+DiGeorge+Syndrome.">Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).</li><li>Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+transplantation.">Thymus transplantation.</a> Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).</li><li>Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+peripheral+T-cell+depletion+in+transplantation+tolerance.">The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).</li><li>Albuquerque, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+FOXN1-Deficiency+is+associated+with+ab+double-negative+and+FoxP3++T-cell+expansions+that+are+distinctly+modulated+upon+thymic+transplantation.">Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation.</a> PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).</li><li>Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+transplantation+restores+the+repertoires+of+forkhead+box+protein+3+(FoxP3)++and+FoxP3-+T+cells+in+complete+DiGeorge+anomaly.">Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly.</a> Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).</li><li>Savino, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thymus+is+a+common+target+organ+in+infectious+diseases.">The thymus is a common target organ in infectious diseases.</a> PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).</li></ol>

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd...

الغدة الصعترية هي الجهاز الذي الأحداث الهامة في تطوير الخلايا T تحدث 1. thymocytes المقيمين، على إعادة ترتيب الخلايا التائية مستقبلات (TCR) α و β الجينات، الخضوع لسلسلة من التفاعلات مع الخلايا lymphostromal ومقدمة للمستضد (APC) في المناطق القشرية والنخاعية من الغدة الصعترية 2. وتتوسط التوتة اختيار إيجابية من الخلايا الظهارية الغدة الصعترية القشرية (TEC) لإنتاج thymocytes التي تعترف الببتيدات المستضدات في سياق المضيفة الرئيسية معقد التوافق النسيجي (MHC) الصف الأول والثاني جزيئات 2-3. اللاحقة اختيار السلبية الغدة الصعترية تستلزم تطهير thymocytes autoreactive، يقودها التفاعل مع TEC النخاع أو الخلايا الجذعية (DC) أن الببتيدات الحالية المستمدة من البروتينات الذاتي ملزمة MHC من الدرجة الأولى والثانية الجزيئات 3. النتيجة النهائية لهذه العمليات هو إنشاء مجموعة من خلايا CD4 + ناضجة وCD8 + T قادرة على الرد على طيف واسعمن المستضدات الأجنبية، وفى نفس الوقت الحد الأدنى من التفاعل للبروتينات الذاتي 4. ويتأثر كفاءة أحداث اختيار الغدة الصعترية من قبل مجموعة من العوامل، بما في ذلك نضج الغدة الصعترية، وتواتر النخاع وTEC القشرية، وتكوين فرعية من الغدة الصعترية DC، ومصدر السلائف الغدة الصعترية 3. والجدير بالذكر، أن اختيار الغدة الصعترية الشاذة يؤدي في المناعة الذاتية 5 أو العوز المناعي الأمراض التي تنشأ من ضعف اختيار سلبية أو إيجابية، على التوالي. الأحداث الجزيئية التي تنظم اختيار الغدة الصعترية، ومع ذلك، غير مفهومة. في المختبر النهج مثل reaggregate الثقافات الجهاز الغدة الصعترية (RTOC) 6، وقد ثبت أن تكون مفيدة لتحليل الأحداث الأساسية المرتبطة اختيار الغدة الصعترية، لكنه يفشل في ألخص تماما ديناميكية مستمرة في أحداث الجسم الحي. ونتيجة لذلك، تم إنشاء هذا النهج القائم على زرع الغدة الصعترية إلى أفضل الأحداث الدراسة اختيار خلية توتية في الجسم الحي 7 </sتصل&gt;. يصف هذا البروتوكول زرع التوتة من الفئران المانحة حديثي الولادة وتعليم الكبار في الفئران المتلقي SCID العوز المناعي. تسمح هذه التقنية على دراسة الآليات التي تنظم اختيار الغدة الصعترية الإيجابية والسلبية، وكذلك انتاج الغدة الصعترية من مختلف مجموعات فرعية الخلايا T أثناء تطور الجنين. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدم هذا النهج لإثبات أن كفاءة اختيار الغدة الصعترية يقتصر في وقت مبكر بعد الولادة لدى الفئران مما يؤدي إلى زيادة نمو الخلايا T autoreactive، وانخفاض الخلايا التائية ذخيرة محددة لمستضدات الخارجية 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2705HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Solution</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>67618-150-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures (1.0 metric)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J493G</td>
			<td>18&#34; (45cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTOCLIP Wound Clips (9mm)</td>
			<td>Clay Adams&#174; Brand</td>
			<td>427631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td>Sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD3 Ab</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0031-85</td>
			<td>Clone: 1452C11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD4 Ab</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Clone: RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD8 Ab</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0081-82</td>
			<td>Clone: 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lancet</td>
			<td>Medipoint</td>
			<td>Goldenrod 4mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P30253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round botton polypropylene plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2mL polypropylene cluster tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40uM Nylon Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Optical Ointment</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td>60mm x 15mm, Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.

ولا تزال الآليات التي تنظم فعالية اختيار الغدة الصعترية سيئة التحديد. الطريقة المعروضة هنا يسمح في التحليلات المجراة من تطوير واختيار خلايا T معينة للدفاع عن النفس والمستضدات الأجنبية. النهج ينطوي زرع الطعوم الغدة الصعترية المستمدة من مختلف الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين المستفيدين في SCID العوز المناعي. خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن وأعيد المستلمين تماما مع خلايا T المستمدة من الكسب غير المشروع الغدة الصعترية مزروع. بذر thymocytes فقط الغدة الصعترية في وقت العزلة الخضوع اختيار وتتطور إلى خلايا T الناضجة. على هذا النحو، يمكن تقييم التغيرات في طبيعة وخصوصية الخلايا T المغروسة بوصفها وظيفة من الأحداث الغدة الصعترية التي تعتمد على العمر. على الرغم من الخبرة الفنية اللازمة لزرع الغدة الصعترية ناجحة، وهذه الطريقة توفر استراتيجية فريدة من نوعها للدراسة في الجسم الحي مجموعة واسعة من الأمراض التي ترجع إلى نتيجة أو وظيفة و / أو homeostas الغدة الصعترية الشاذةهو.

نجاح هذا الإجراء يعتمد على الحد الأدنى من الصدمة الجراحية فضلا عن دقة تحديد المواقع من الكسب غير المشروع تحت كبسولة الكلى. يجب أن تقطع الكسب غير المشروع الغدة الصعترية لضمان الحجم أقسام الغدة الصعترية لزرع احقا بشكل مناسب كما هو مبين في الشكل 1. وبعد التخطيط?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts. at JoVE.com

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

العزل وزرع مختلفة المسنين الفئران التوتة الطعوم.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

العزلة وتدفق Cytometric توصيف الفئران الصغيرة المعوية اللمفاويات

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

إعداد وتطبيقات الثقافات عضوي التوتة شريحة

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...