Name: controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation
Uploaded: 2015-06-04T14:00:00
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この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会によってサポートされていました。微細加工は、マギル大学のマギルナノツールのMicroFab施設、カールトン大学の電子部門の支援を受けて実施しました。

血液は、オタワ大学（H11-13-06）の倫理委員会の承認を得て、健康な個体から収集されます。 1.マイクロチャネルの作製マイクロチャネルは、標準的なフォトリソグラフィ法18に基づいて製造されています。 <ol><li>コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、マイクロチャネルの幾何学的形状を設計し、透明性のフォトマスクの設?...

<ol>
	<li>Perkkio, J., Keskinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematocrit+reduction+in+bifurcations+due+to+plasma+skimming.">Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming.</a> Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).</li><li>Chien, S., Jan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+basis+of+the+mechanism+of+rouleaux+formation.">Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation.</a> Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).</li><li>Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion-mediated+red+blood+cell+aggregation+in+polymer+solutions.">Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions.</a> Biophys. 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Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).</li><li>Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+red+blood+cell+aggregability+in+a+flow+chamber+by+computerized+image+analysis.">Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis.</a> Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+algorithms+for+microscale+particle+image+velocimetry.">Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry.</a> AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).</li><li>Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+measurement+accuracy+in+micro+PIV+by+image+overlapping.">Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping.</a> Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).</li><li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow:+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods.">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).</li><li>Bhamare, M. G., Patil, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+blood+cell+analysis+by+using+digital+image+processing:+a+preliminary+study.">Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study.</a> Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).</li><li>Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform.</a> Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Jambhekar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells+classification+using+image+processing.">Red blood cells classification using image processing.</a> Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li></ol>

本発明の方法論を使用して、異なる流れ条件及びヘマトクリット下定性的および定量RBC凝集体を分析することが可能です。成功したテストと集計検出のためには、マイクロチャネルの入口に二つの流体の間の適切な速度比を決定するために重要です。この比は、速度プロファイル19準線形である最適な血液層の厚さを得ることは非常に重要です。 成功したテスト?...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

赤血球（RBC）は、血液のレオロジー挙動を決定する上で重要な役割を果たしています。彼らは、ほぼ単独でin vitroおよびin vivoでの血液の特定の性質を担当しています。生理的条件下では、赤血球は、血液量の40％〜45％を占めます。微小循環において、赤血球は、より小さな血管径とプラズマスキミング効果1の血液量の20％までを占めます。微小循環における血漿低減のこの現象は、フォーレウス効果として知られています。低剪断速度では、赤血球は、したがって、血液の非ニュートン挙動に寄与し、一緒にブリッジと「連銭」または凝集体と呼ばれる一次元又は三次元構造を形成することができます。しかし、RBC凝集のメカニズムは完全に理解されていません。二つの理論は、RBCの凝集をモデル化するために存在する：細胞理論の橋渡しを起因高分子2の架橋及び力attracへ浸透勾配3に起因する分子の枯渇によって引き起こさ化理論。 典型的には、ヒトの血液のために、凝集体は、1〜10秒-1までの範囲の非常に低いせん断速度4で形成されます。この範囲を超えると、RBCが脱凝集し、血管内に別々に流れる傾向にあります。 凝集体形成の条件を理解することは、血液のレオロジー挙動を定義するという点で血液レオロジーの分野に非常に重要です。これらの凝集体は、多くの場合、macrocirculationレベル（&gt; 300μmの直径）5で見られています。このスケールでは、血液は、ニュートン流体と均一な混合物と見なされます。しかし、これらの凝集体はほとんど毛細管レベル（直径4-10μm）の中に見られないと、通常、糖尿病6や肥満などの病的状態の指標です。 RBC凝集を変えることができる他の病的状態は、炎症性または感染状態を含み、高血圧やアテローム性動脈硬化症、遺伝性疾患および慢性疾患7などの心血管疾患。したがって、赤血球凝集メカニズムを理解し、（これらの凝集体の大きさや流れの状態との間の関係を定義することによって）、これらのエンティティを分析して、血液のmicrorheological行動の理解につながるので、臨床応用にそれを関連付けることができます。 RBC凝集物は、ヘマトクリット値（血液中の赤血球の体積）、剪断速度、血管径、RBC膜の剛性および懸濁培地組成8-10のようないくつかの要因によって変更することができます。したがって、制御された条件は、効果的にRBC凝集体を分析するために必要とされます。いくつかの方法は、血液の動作に関連する情報を提供しています静的アグリゲーション測定（集計インデックス）を提供することにより、凝集体形成を解析することができます。これらの方法は、とりわけ、赤血球沈降速度を含みます方法11、光透過法12、光反射法13と低剪断粘度法14。 いくつかの研究は、RBC凝集を研究し、制御された流れ条件15-17における凝集の程度を決定することを試みました。しかし、これらの研究は、間接的に凝集の程度についての情報だけでなく、地元の粘度を提供する顕微鏡血液画像に基づいて測定された剪断システム内の占有スペースの比率を決定することにより、赤血球凝集体の大きさを調べます。 そこで、直接制御し、一定のせん断速度下で、動的に、RBCは、微小循環に集約定量化するための新しい手順を提示します。 RBC懸濁物は、したがって、血液層にせん断流を作り出すリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を、（ 図1に示されるように）二重Y字型マイクロチャネルに、同伴されます。この血液層定数シア以内R率を得ることができます。 RBC懸濁物は、異なるヘマトクリット値（H）レベル（5％、10％及び15％）で異なる剪断速度（2-11秒-1）下で試験されます。血流速度および剪断速度は、フローは、高速カメラを用いて可視化されている間、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。得られた結果は、赤血球を検出し、凝集体のサイズを決定するために、画像強度に基づいて、MATLABコードで処理されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

血液は、非ニュートン生体液として、血液レオロジーの分野における多くの研究の焦点を表します。血液成分は、血漿中に懸濁された赤血球、白血球及び血小板を含みます。によるRBCの存在量（血液量の40％〜45％）に、彼らの行動は、特に微小循環の血液のレオロジー挙動を決定します。非常に低いせん断速度で、RBCが組み立てに見られている、フォームの実体は、血液の非ニュートン挙動を引き起こす、凝集体と呼ばれます。これは、微小循環における血液レオロジーを把握するために、凝集体形成の条件を理解することが重要です。ここで説明するプロトコルは、画像処理に基づいて、一定のせん断速度下で定量的に微小循環におけるRBC凝集体を決定するための実験手順について詳しく説明します。この目的のために、RBC-懸濁液は120×60μmのポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネル中で試験され、分析されます。 RBC-懸濁液は、耳鼻咽喉科であります血液層内の線速度プロファイルを得るので、一定の剪断速度の広い範囲を達成するために、第2の流体を使用して雨が降りました。 RBC凝集は、高速カメラを用いて可視化しながら剪断速度は、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。 RBC凝集体の捕捉されたビデオは、画像強度に基づいて、集合のサイズを決定するために画像処理技術を用いて分析されます。

ヒトの赤血球が5％、10％、15％ヘマトクリットで懸濁し、10μL/ hrで流れるために二重Y-マイクロチャネル内の2つの流体の流れの例を図2に示されている。 図3は、時集合サイズの差を示していますチャネル内の流れは、10％のヘマトクリット5μL/時間に10μL/時から減少されます。ヘマトクリットおよびせん断速度を変化させたときに凝集体の大きさの定性的な概念を与え...

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

プロトコルは、画像処理技術に基づいて、詳細に制御され、一定の剪断速度の下で赤血球（RBC）の凝集体を定量化するための実験手順を記載しています。このプロトコルの目的は、制御されたマイクロ流体環境で対応するせん断速度に赤血球凝集体のサイズを関連付けることです。

赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

全血からの超高感度のタンパク質検出のための全自動遠心マイクロ流体デバイス

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

バルブ付き多層マイクロ流体デバイスのための多段階可変高さのフォトリソグラフィ

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...