Name: controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation
Uploaded: 2015-06-04T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. Microfabricación se realizó con el apoyo de la instalación McGill nanoherramientas Microfab en la Universidad McGill y el Departamento de Electrónica de la Universidad de Carleton.

La sangre se recoge de los individuos sanos, con la aprobación del comité de ética de la Universidad de Ottawa (H11-13-06). 1. Microchannel Fabrication Los microcanales son fabricados en base a los métodos estándar de fotolitografía 18. <ol><li> Diseñar la geometría microcanal utilizando un diseño (CAD) asistido por ordenador e imprimir la configuración en una transparencia foto-máscara. Estas máscaras son cruciales ya que dictan la traye...

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	<li>Perkkio, J., Keskinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematocrit+reduction+in+bifurcations+due+to+plasma+skimming.">Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming.</a> Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).</li><li>Chien, S., Jan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+basis+of+the+mechanism+of+rouleaux+formation.">Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation.</a> Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).</li><li>Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion-mediated+red+blood+cell+aggregation+in+polymer+solutions.">Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions.</a> Biophys. 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Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).</li><li>Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+red+blood+cell+aggregability+in+a+flow+chamber+by+computerized+image+analysis.">Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis.</a> Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. 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L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow:+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods.">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).</li><li>Bhamare, M. G., Patil, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+blood+cell+analysis+by+using+digital+image+processing:+a+preliminary+study.">Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study.</a> Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).</li><li>Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform.</a> Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Jambhekar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells+classification+using+image+processing.">Red blood cells classification using image processing.</a> Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li></ol>

Utilizando la presente metodología, es posible analizar cualitativa y cuantitativamente el RBC agregados bajo diferentes condiciones de flujo y hematocritos. Para las pruebas de éxito y la detección agregada, es crucial para determinar la relación de velocidad apropiada entre los dos fluidos en la entrada de microcanal. Esta relación es muy importante para obtener un espesor de capa de sangre óptimo donde el perfil de velocidad es casi lineal 19. Otro factor clave para la pr...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Glóbulos rojos (GR) juegan un papel crucial en la determinación del comportamiento reológico de la sangre. Son casi singularmente responsable de las propiedades particulares de la sangre in vitro e in vivo. En condiciones fisiológicas, los glóbulos rojos ocupan 40% a 45% del volumen de sangre. En la microcirculación, los glóbulos rojos solamente ocupar hasta el 20% del volumen de la sangre debido a diámetros de los vasos más pequeños y el efecto plasma 1 descremado. Este fenómeno de reducción de plasma en la microcirculación se conoce como el efecto Fåhraeus. A bajas velocidades de cizalla, los glóbulos rojos son capaces de tender un puente juntos y formar uno dimensional o estructuras tridimensionales denominadas &quot;rouleaux&quot; o agregados, por lo tanto, contribuir al comportamiento no newtoniano de la sangre. Sin embargo, el mecanismo de la agregación de RBC no se entiende completamente. Existen dos teorías para modelar la agregación de glóbulos rojos: el puente de la teoría de las células debido a la reticulación de las macromoléculas 2 y la fuerza attracla teoría de la causada por el agotamiento de las moléculas debido al gradiente osmótico 3. Típicamente, para la sangre humana, los agregados forman a velocidades de cizallamiento muy bajas 4 que van de 1 a 10 seg -1. Por encima de este rango, los glóbulos rojos tienden a desagregar y fluir por separado dentro del recipiente. La comprensión de las condiciones de la formación de agregados es de una gran importancia para el campo Hemorreología en términos de definir el comportamiento reológico de la sangre. Estos agregados se ven a menudo en el nivel macrocirculation (&gt; 300 m de diámetro) 5. A esta escala, la sangre se considera como un fluido newtoniano y una mezcla homogénea. Sin embargo, estos agregados se ven raramente en el nivel capilar (4-10 micras de diámetro) y son por lo general una indicación de condiciones patológicas tales como la diabetes y la obesidad 6. Otras condiciones patológicas que podrían cambiar la agregación de glóbulos rojos incluyen condiciones inflamatorias o infecciosas,enfermedades cardiovasculares tales como hipertensión o aterosclerosis, trastornos genéticos y las enfermedades crónicas 7. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo de agregación de RBC y análisis de estas entidades (mediante la definición de una relación entre el tamaño de estos agregados y las condiciones de flujo) podría conducir a la comprensión del comportamiento microrheological de la sangre y por lo tanto relacionarlo con aplicaciones clínicas. Agregados de glóbulos rojos pueden ser alterados por diversos factores tales como el hematocrito (volumen de glóbulos rojos en la sangre), la velocidad de cizallamiento, el diámetro del vaso, la rigidez de la membrana RBC y la composición de medio de suspensión 8-10. Por lo tanto, se requieren condiciones controladas con el fin de analizar de forma eficaz los agregados de glóbulos rojos. Varios métodos son capaces de analizar la formación de agregados al proporcionar mediciones de agregación estáticos (índice de agregación) que ofrece información relevante sobre el comportamiento de la sangre. Estos métodos incluyen, entre otras cosas, la velocidad de sedimentación globularmétodo 11, el método de transmisión de la luz 12, el método de reflexión de la luz 13 y el método de la viscosidad de baja cizalladura 14. Pocos estudios han tratado de estudiar la agregación de glóbulos rojos y determinar el grado de agregación en condiciones de flujo controladas 15-17. Sin embargo, estos estudios investigan indirectamente RBC tamaños de agregados mediante la determinación de la proporción de espacio ocupado en un sistema de cizallamiento medido basado en imágenes microscópicas de sangre que proporcionan información sobre el grado de agregación, así como la viscosidad local. Por lo tanto, presentamos un nuevo procedimiento para cuantificar directamente RBC agregados en la microcirculación, de forma dinámica, bajo velocidades de cizallamiento controladas y constantes. RBC-suspensiones son arrastradas, en una doble Y-microcanal (como se ilustra en la Figura 1), con una solución tampón fosfato salino (PBS) por lo tanto la creación de un flujo de cizallamiento en la capa de sangre. Dentro de esta sangre capa un karité constantetasa r puede ser obtenida. Los RBC-suspensiones se ensayaron a diferente hematocrito (H) niveles (5%, 10% y 15%) y bajo diferentes velocidades de cizallamiento (2-11 seg -1). La velocidad de la sangre y la velocidad de cizallamiento se determinan mediante un sistema de micro Velocimetría imágenes de partículas (μPIV), mientras que el flujo se visualizaron utilizando una cámara de alta velocidad. Los resultados obtenidos se procesan entonces con un código MATLAB basado en las intensidades de imagen con el fin de detectar los glóbulos rojos y determinar tamaños de agregados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

La sangre, como biofluido no newtoniano, representa el foco de numerosos estudios en el campo Hemorreología. Constituyentes de la sangre incluyen glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas que se encuentran suspendidas en el plasma sanguíneo. Debido a la abundancia de los glóbulos rojos (40% a 45% del volumen de sangre), su comportamiento dicta el comportamiento reológico de la sangre especialmente en la microcirculación. A velocidades de cizallamiento muy bajas, los glóbulos rojos se ven de montar y entidades forma llamada agregados, lo que provoca el comportamiento no newtoniano de la sangre. Es importante entender las condiciones de la formación de agregados de comprender la reología de la sangre en la microcirculación. El protocolo descrito aquí detalla el procedimiento experimental para determinar cuantitativamente los agregados de glóbulos rojos en la microcirculación bajo velocidad de cizallamiento constante, basado en procesamiento de imágenes. Para este propósito, RBC-suspensiones se prueban y se analizaron en microcanales 120 x 60 micras de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Los RBC-suspensiones son entllovió usando un segundo fluido con el fin de obtener un perfil de velocidad lineal dentro de la capa de sangre y así lograr una amplia gama de velocidades de cizalladura constantes. La velocidad de cizallamiento se determina usando un sistema de micro velocimetría por imágenes de partículas (μPIV), mientras que los agregados de glóbulos rojos se visualizaron utilizando una cámara de alta velocidad. Los vídeos capturados de los agregados de glóbulos rojos se analizaron utilizando técnicas de procesamiento de imágenes con el fin de determinar los tamaños de los agregados basados ​​en las imágenes de intensidades.

Un ejemplo del flujo de dos fluidos en la doble Y-microcanal se muestra en la Figura 2 para los glóbulos rojos humanos en suspensión en 5%, 10% y 15% de hematocrito y que fluye a 10 l / hr. La Figura 3 muestra la diferencia en tamaños de agregados cuando el flujo en el canal se reduce de 10 l / hr a 5 l / h para un hematocrito de 10%. Esto da una idea cualitativa de los tamaños de los agregados cuando se varía el hematocrito y la velocidad de cizallamiento. La figura 5</str...

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

El protocolo describe los detalles de un procedimiento experimental para cuantificar de glóbulos rojos (RBC) agregados bajo un régimen de cizalladura controlada y constante, basado en técnicas de procesamiento de imágenes. El objetivo de este protocolo es relacionar tamaños de agregados de glóbulos rojos a la velocidad de cizallamiento correspondiente en un entorno controlado de microfluidos.

Medio Ambiente Microfluidic controlada de Investigación Dinámica de agregación de glóbulos rojos

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

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