Name: in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma
Uploaded: 2015-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma at JoVE.co

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

In vivo beeldvorming wordt uitgevoerd in pathogeenvrije faciliteiten met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Utah goedgekeurd. Opmerking: Deze imaging protocol wordt gebruikt voor reporter muizen die retinale microglia en infiltrerende monocyten / macrofagen tot expressie groen-fluorescerend eiwit (GFP) onder de controle van de fractalkine receptor locus (CX3CR1). 1. In vivo beeldvorming van het netvlies GFP ...

Live bewaking van microgliale celaantal en morfologische activatie bij een neurodegeneratieve ziekte vereist het gebruik van niet-invasieve beeldvorming methoden dat de gedetailleerde visualisatie van cel functies mogelijk. Na beeldvorming, moet microgliale cellen worden geïsoleerd (gesegmenteerd) voor morfometrische analyse met gebruik van meervoudige drempel stappen Somal grootte en / of complexiteit van het proces als uitlezingen voor microglia activatie beoordelen. In dit protocol beschrijven we methoden voor liveb...

Microglia vormen neuroimmune cellen die uitsluitend bevinden in het centrale zenuwstelsel (CNS) sinds de vroege embryonale ontwikkeling en de volwassen leeftijd. Voorzien van een complex repertoire receptoren, microgliale activiteit en regionale heterogeniteit worden geregeld door de bidirectionele interactie met aangrenzende neuronen, glia, bloed-hersenbarrière en infiltrerende cellen neuroinflammatory 1,2. Basale microglia functies bijdragen aan fysiologische onderhoud en reparatie, omdat ze proeven op hun grondgebied voor verstoringen in de homeostase 3,4. Tijdens CNS verwonding of ziekte, microglia zijn de first responders om neuronale signalen die vervolgens leiden tot de overgang naar een reactieve fenotype, aangeduid als &quot;geactiveerde microglia 2,5-7. Microglia-activatie gaat om een ingewikkelde cyclus van gen en eiwit expressie, die gekoppeld zijn aan de cel soma en proces resizen en remodeling 6-9. Microglia activatie, alsook cellen Redistributieclustering kan vergezeld de plaatselijke totale stijging van het aantal cellen (genoemd microgliosis). Dit kan het gevolg zijn van celproliferatie en zelfvernieuwing, al dan niet rekrutering van bloed monocyten 3,4,7,10-14. In een breed scala van leeftijdsafhankelijke, chronische CNS ziekten, aanhoudende microgliose en microglia-activatie parallel progressie van de ziekte 15-19. Hoe microglia invloed neurodegeneratie blijft onduidelijk, vooral omdat ze allebei neurobeschermend en schadelijke rollen die diverse bijdragen aan de ziekte ontstaan ​​en de progressie kan hebben afgespeeld. Live-imaging studies gericht op het begrijpen chronische ziekte CNS hebben microglia gedrag in de beschadigde CNS diermodellen en mensen gecontroleerd en aangetoond dat microglia wijzigingen zijn detecteerbaar begin in de vroege stadia van de ziekte 15-17,19,20. Het is dus essentieel om benaderingen te sporen en te controleren microgliale activering in vivo ontwikkelen. Niet-invasieve detectie van de regionale veranderingen in de hersenen microglia activering werd opgericht als een belangrijke in vivo indicator van neurodegeneratieve progressie van de ziekte, met behulp van moleculaire beeldvorming of bioluminescentie en positron emissie tomografie of magnetische resonantie beeldvorming 18,21,22. Deze zeer kwantitatieve en non-invasieve moleculaire en nucleaire beeldvorming opsporen gliosis regionale oplossing. Als alternatief, twee-foton confocale beeldvorming in CX3CR1 GFP / + muizen kon de observatie van de hersenen microglia met cellulaire resolutie 3,4,9,20,23-28. Deze benadering beperkt langdurige en herhaalde observatie van chronische microgliale veranderingen, daar het gevaar bestaat van hun gedrag verstoren door ten minste minimaal invasieve brain imaging procedures 29. Als alternatief, het netvlies biedt optimale omstandigheden voor directe, in vivo visualisatie en herhaalde controle van microglia in hun intact CNS niche gedurende veroudering, na acuut letsel, eneventueel tijdens chronische neurodegeneratieve aandoeningen. Zo hebben recente onderzoeken de haalbaarheid van een hoge-resolutie beeldvorming van het netvlies microglia die GFP bewezen door het aanpassen van de confocale laser scanning oftalmoscopie (cSLO) naar het live-CX3CR1 GFP / + muizen. Deze is gebruikt om wekelijks veranderingen in GFP + celaantallen in individuele muizen gedurende maximaal 10 weken volgen na acuut geïnduceerd letsel of oculaire hypertensie 30-36. We hebben deze benadering uitgebreid tot langdurige imaging voeren gedurende enkele maanden, en kwantitatief veranderingen in microglia activatie basis van soma size middels morfometrische analyse volgen. Somal grootte werd gedefinieerd als nuttige metriek van microglia activatie in levende imaging studies met behulp van twee-foton confocale microscopie in corticale schijfjes te functioneren in vivo beeldvorming van CX3CR1-GFP + microglia 9. Deze en andere studies toonden ook het verband tussen Somal shape and Iba1 niveaus van eiwitexpressie, which verhoogt ook activatie 9,37. Aldus kan geactiveerde microglia worden geïdentificeerd levende muizen, en hun aantal en verdeling in de tijd gevolgd bij CNS gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft werkwijzen voor cSLO levende beeldacquisitie en analyse microgliale cel aantallen, distributie en morfologische activatie tijdens retinale ganglioncellen (RGC) degeneratie (figuur 1) bewaken. Aldus is deze studie gebruikt: 1) een muismodel van erfelijke glaucoom (DBA / 2J) die leeftijdsafhankelijke oogzenuw en netvlies neurodegeneratie en ondergaat toont opmerkelijke variatie in ziekteprogressie tussen 5 en 10 maanden 38,39, 2) maandelijkse cSLO in vivo imaging voor langdurige visualisatie van GFP + cellen in de retina en optische zenuw ongemyelineerde heterozygote CX3CR1 GFP / + DBA / 2J muizen 3-5 maanden, 3) levende beeldanalyse door het segmenteren en drempelwaarden naar cel somata en meten isoleren leeftijd deir gebied. Deze strategieën zijn toegepast om de kinetiek van retinale microgliale activatie toestanden beoordelen tijdens de vroege stadia van chronisch glaucoom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

Microglia, die CNS-resident neuro-cellen zijn, te transformeren van hun morfologie en grootte in reactie op de CNS-letsel, schakelen naar een geactiveerde staat met verschillende functies en genexpressie profielen. De rollen van microgliale activering in gezondheid, verwondingen en ziekten blijven onvolledig begrepen vanwege hun dynamische en complexe regulering in reactie op veranderingen in hun micromilieu. Het is dus essentieel om niet-invasief bewaken en veranderingen in microgliale activering tijd in het intacte organisme te analyseren. In vivo studies van microglia activering zijn vertraagd door technische beperkingen aan het volgen van microglia gedrag zonder dat de CNS milieu. Dit is bijzonder moeilijk geweest tijdens chronische neurodegeneratie, waar de veranderingen op lange termijn moet worden gevolgd. Het netvlies is een CNS orgaan vatbaar is voor non-invasieve beeldvorming levende, een krachtig systeem te visualiseren en de dynamiek van microglia activatie karakteriseren tijdens chronische aandoeningen. in vivo beeldvorming van retinale microglia, via confocale oftalmoscopie (cSLO) en CX3CR1 GFP / + reporter muizen te microglia met cellulaire resolutie te visualiseren. Ook beschrijven we methoden om de maandelijkse veranderingen in cel activatie en dichtheid in grote cel subsets (200-300 cellen per netvlies) te kwantificeren. Wij bevestigen het gebruik van Somal gebied als een nuttige metrische live volgen van microgliale activering in het netvlies door het toepassen van geautomatiseerde-drempel op basis van morfometrische analyse van in vivo afbeeldingen. Wij gebruiken deze live image registratie en verwerking strategieën om de dynamische veranderingen in microgliale activering en microgliose volgen tijdens de vroege stadia van retinale neurodegeneratie in een muizenmodel van chronische glaucoom. Deze benadering is handig voor de bijdragen van microglia neuronale en axonale afname van chronische CNS aandoeningen die de retina en optische zenuw invloed te onderzoeken.

Onze recente in vivo studies gebruikten deze levende beeldacquisitie en analysemethoden te visualiseren en volgen de kinetiek en patronen van ONH en retinale microgliale veranderingen tijdens vroege stadia van chronisch glaucoom en hun relatie tot eind neurodegeneratie 59. Hier tonen we een cSLO beeldacquisitie protocol microgliale cellen te visualiseren over een groot gebied van de centrale retina individuele jonge heterozygote CX3CR1-GFP DBA / 2J retina (Figuur 5). Op basis van de ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma at JoVE.co

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo bioluminescentie van Tumor Hypoxie Dynamiek van Borstkanker hersenmetastasen in een muismodel

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo beeldvorming van tumorale angiogenese met behulp van fluorescentie confocale videomicroscopie

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI voor mobiele Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequentiële<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intra-uteriene Telemetrie naar Mouse Contractiele druk te meten<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis door confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoom-inducerende Procedure in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Model en Whole-mount Retina Voorbereiding

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Uitputting van de Muis Cellen van geënte, humane tumoren verbetert Downstream Analyse van Target Cellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...