Name: in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma
Uploaded: 2015-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma at JoVE.co

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

in vivoイメージングではユタ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して病原体を含まない施設で行われています。 注：このイメージングプロトコルは、網膜ミクログリアおよび浸潤単球/マクロファージは、フラクタルカイン受容体遺伝子座（CX3CR1）の制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するレポーターマウスのために使用されます。 <p c...

神経変性疾患の間の小グリア細胞の数および形態学的活性化のライブモニタリングは、細胞機能の詳細な視覚化を可能にする非侵襲性の画像化方法を使用する必要があります。撮影後、ミクログリア細胞は、ミクログリアの活性化のための読み出しとしてソマリ族のサイズおよび/またはプロセスの複雑さを評価するために、複数のしきい値工程の使用により、形態学的分析のために（セグメ...

ミクログリアはもっぱら初期胚発生以来と成人期を通じて、中枢神経系（CNS）に存在する神経免疫細胞です。受容体の複雑なレパートリーを搭載し、ミクログリア活性および地域の異質性は、隣接するニューロン、グリア、血液脳関門および神経炎症細胞1,2浸潤との双方向の相互作用によって調節されています。基礎ミクログリア関数は、ホメオスタシス3,4における摂動のために自国の領土をサンプルとして、生理的なメンテナンスや修理に貢献しています。 CNS傷害または病気の間に、ミクログリアは、その後、反応性の表現型への移行を誘発する神経信号に第一応答者であり、「ミクログリア2,5-7活性化と呼ばれます。ミクログリアの活性化は、細胞体およびプロセスのサイズ変更に結合され、6-9の改造された遺伝子およびタンパク質発現の複雑なサイクルを伴います。ミクログリアの活性化、ならびに細胞の再分配とクラスタリングは、セルの数（と呼ばれる小膠）の局所的な全体的な増加を伴うことができます。これは、細胞増殖および自己再生から、または血液由来の単球の動員3,4,7,10-14ことなくもたらすことができます。年齢依存、慢性CNS疾患の広い範囲に、小膠細胞およびミクログリアの活性化、並列疾患進行15-19を持続。どのようにミクログリア衝撃神経変性は、彼らは、疾患の発症および進行に多様な貢献を有することができ、両方の神経保護および有害な役割を果たしている主な理由は、不明のままです。慢性CNS疾患を理解することを目的としたライブイメージング研究は、動物モデルおよびヒトの損傷したCNSにおける小膠細胞の挙動を監視し、ミクログリアの変化は疾患の初期段階で検出15-17,19,20始まりであることを実証しました。従って、 インビボでのミクログリアの活性化を検出し、監視するためのアプローチを開発することが重要です。 非侵襲的DETE脳のミクログリアの活性化の地域変化のctionは、分子イメージングまたは生物発光と陽電子放射断層撮影法または磁気共鳴画像18,21,22を用いて、神経変性疾患の進行のインビボ指標で重要なものとして設立されました。これらの高度に定量的および非侵襲的な分子と核イメージング法は、地域の分解能で神経膠症を検出します。あるいは、CX3CR1 GFP / +マウスにおける二光子共焦点イメージングは、細胞解像度3,4,9,20,23-28で脳のミクログリアの観察を可能にしました。しかし、この方法は、さらに低侵襲的脳イメージング手順29によってその動作を妨害する潜在的なリスクを考慮すると、長期的な慢性のミクログリアの変化の繰り返し観察を制限します。あるいは、網膜は、急性損傷後の、 生体内可視化と高齢化を通じて、その無傷のCNS ​​のニッチにおけるミクログリアの繰り返しモニタリングで 、直接に最適な条件を提供し、潜在的に慢性神経変性疾患中。したがって、最近の研究では、画像に共焦点走査型レーザー検眼鏡（cSLO）ライブCX3CR1 GFP / +マウスを適合させることにより、GFPを発現する網膜ミクログリアの高分解能イメージングの可能性を証明しています。これは、誘導された急性傷害または高眼圧症30-36以下の最大10週間、個々のマウスにおけるGFP +細胞数の毎週の変化を追跡するために使用されています。 我々は、数ヶ月にわたって長期撮影を行い、定量的形態計測分析を用いて、細胞体の大きさに基づいて、ミクログリアの活性化の変化を追跡するために、このアプローチを拡張しました。ソマリ族サイズがCX3CR1-GFP +ミクログリア9のインビボイメージングに実行するために、皮質切片における二光子共焦点顕微鏡を使用してライブイメージング研究におけるミクログリア活性化の有用な基準として定義しました。これらおよび他の研究はまた、WH、ソマリ族サイズとIBA1タンパク質発現のレベルの間の相関関係を示しましたICHはまた、活性化9,37とともに増加します。したがって、活性化ミクログリアは、生きたマウスにおいて同定することができ、それらの数および分布は、中枢神経系の健康と病気の間に経時的にモニター。 このプロトコルは、cSLOライブ画像の取得と分析のための方法は、ミクログリア細胞数、網膜神経節細胞（RGC）の変性（ 図1）の間に分布し、形態学的な活性化を監視することについて説明します。このように、本 ​​研究では使用しています。年齢依存性視神経と網膜神経変性を受け、年齢38,39の5と10ヶ月の間、疾患の進行の著しい変動を示し、継承緑内障（DBA / 2J）の1）マウスモデルを、2）毎月細胞細胞体と測定を分離するヘテロ接合CX3CR1 GFP / + DBA / 2Jマウスの網膜および無髄視神経におけるGFP +細胞の長期的な可視化高齢者3-5ヶ月のcSLO in vivoイメージング、セグメンテーションと閾値による3）ライブイメージング解析ザIR領域。これらの戦略は、慢性緑内障の初期段階網膜ミクログリアの活性化状態の動態を評価するために適用されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

CNS常駐神経免疫細胞であるミクログリアは、異なる機能や遺伝子発現プロファイルを用いて活性化状態に切り替え、CNS損傷に応答してその形態と大きさを変換します。健康、傷害および疾患におけるミクログリアの活性化の役割が不完全に、それらの微小環境の変化に応じて、そのダイナミックで複雑な規制に理解されたままです。これにより、非侵襲的にモニターするために重要であり、無傷の生物の経時ミクログリアの活性化の変化を分析します。ミクログリアの活性化のインビボ研究では、CNS環境を変えることなく、ミクログリアの行動を追跡することに技術的な限界により遅延されています。これは長期的な変化を追跡する必要があり、慢性神経変性、中に特に困難でした。網膜、非侵襲的なライブイメージングの影響を受けやすいCNS器官は、慢性障害時にミクログリアの活性化の動態を可視化し、特徴づけるための強力なシステムを提供しています。 、in vivoイメージング、携帯解像度でミクログリアを可視化するために、共焦点検眼鏡（cSLO）とCX3CR1 GFP / +レポーターマウスを使用する方法の概要を説明します。また、我々は大規模な細胞サブセットでの細胞の活性化および密度の月次変化（網膜あたり200〜300細胞）を定量化するための方法を記載しています。我々は、in vivoでの画像の自動化されたしきい値ベースの形態学的分析を適用することにより、網膜における小グリア細胞活性化のライブ追跡するのに有用な測定基準としてソマリ族領域の使用を確認します。我々は、これらのライブ画像の取得を使用して、慢性緑内障のマウスモデルにおける網膜神経変性の初期段階ミクログリア活性化および小膠細胞の動的変化を監視するための戦略を分析します。このアプローチは、網膜や視神経に影響を与える慢性CNS障害におけるニューロンおよび軸索の減少にミクログリアの貢献を調査するのに有用であるべきです。

我々の最近のin vivoでの研究は、59後期神経変性に慢性緑内障およびそれらの関係の初期段階ONHおよび網膜ミクログリアの変化の速度とパターンを視覚化し、追跡するために、これらのライブ画像の取得及び分析方法を使用していました。ここでは、個々の若いヘテロ接合CX3CR1-GFPのDBA / 2J網膜における網膜中心（ 図5）の大領域にわたってミクログリア細胞を可視化?...

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In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

ミクログリアの活性化および小膠は、慢性神経変性に重要な応答です。ここでは、in vivoで 、共焦点検眼鏡による網膜CX3CR1-GFP +ミクログリア細胞の長期的な可視化のための方法を提示し、閾値と形態計測のために識別し、それらの活性化を定量化するために分析します。我々は、年齢関連の緑内障の早期の段階でミクログリアの変化を監視します。

共焦点検眼鏡イメージングとマウス緑内障における細胞の形態計測：神経変性中に網膜ミクログリアの活性化のインビボダイナミクス

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

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