Name: in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma
Uploaded: 2015-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma at JoVE.co

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

In vivo avbildning utføres i patogenfrie anlegg ved hjelp protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Utah. MERK: Denne avbildningsprotokollen blir brukt for rapportør mus der retinale mikroglia og infiltrerende monocytter / makrofager uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av den fractalkine reseptoren locus (CX3CR1). 1. in vivo avbildning av Netthinne GFP + Microglia av Confocal Scanning Laser ophthalmos...

Levende overvåking av microglial celleantall og morfologisk aktivering i løpet av en nevrodegenerativ sykdom krever bruk av ikke-invasive avbildningsmetoder som tillater detaljerte visualisering av cellefunksjoner. Etter avbildning, må mikrogliale celler isoleres (segmentert) for morfometrisk analyse ved bruk av flere terskeltrinn til å vurdere Somal størrelse og / eller prosesskompleksitet som avlesninger for mikroglia aktivering. I denne protokollen beskriver vi metoder for live bildeoverføring ved hjelp cSLO, o...

Mikroglia er neuroimmune celler som utelukkende oppholder seg i sentralnervesystemet (CNS) siden tidlig embryoutvikling og gjennom hele voksenlivet. Utstyrt med en kompleks repertoar av reseptorer, er microglial aktivitet og regional heterogenitet regulert av deres toveis samspill med nabo nevroner, gliaceller, blod-hjernebarrieren og infiltrere neuroinflammatoriske celler 1,2. Basale mikrogliaceller funksjoner bidra til fysiologiske vedlikehold og reparasjoner, som de smake deres territorium for forstyrrelser i homeostase 3,4. Under CNS skade eller sykdom, mikroglia er de første responders til nevronale signaler som deretter utløser deres overgang til en reaktiv fenotype, kalt &quot;aktivert microglia 2,5-7. Mikroglia aktivering innebærer en intrikat syklus av genet og protein uttrykk, som er koblet til celle soma og prosess skalering og ombygging 6-9. Mikroglia aktivering, samt celle omfordeling ogclustering, kan være ledsaget den lokale generell økning i antall celler (betegnet microgliosis). Dette kan resultere fra celleproliferasjon og selvfornyelse, med eller uten rekruttering av blodavledede monocytter 3,4,7,10-14. I et bredt spekter av aldersavhengig, kroniske CNS sykdommer, vedvarende microgliosis og mikroglia aktivering parallell sykdomsprogresjon 15-19. Hvordan mikroglia innvirkning neurodegenerering fortsatt uklart, hovedsakelig fordi de spiller både nervecellene og skadelige roller som kan ha ulike bidrag til sykdomsutbruddet og progresjon. Live-imaging studier som tar sikte på å forstå kronisk CNS sykdom har overvåket microglial atferd i den skadede CNS dyremodeller og mennesker, og viste at mikrogliaceller forandringer kan påvises begynnelsen på tidlige sykdomsstadier 15-17,19,20. Det er således viktig å utvikle fremgangsmåter for å påvise og overvåke microglial aktivering in vivo. Non-invasiv DeteDette skjer av regionale endringer i hjernens mikroglia aktivering ble etablert som en viktig in vivo indikator på nevrodegenerativ sykdom progresjon, ved hjelp av molekylær avbildning eller Bioluminescens og positronemisjonstomografi eller magnetisk resonanstomografi 18,21,22. Disse svært kvantitative og ikke-invasive molekylære og kjernefysisk avbildningsmetoder oppdage gliose med regional oppløsning. Alternativt har to-foton confocal bildebehandling i CX3CR1 GFP / + mus tillot observasjon av hjerne mikroglia med mobilnettet oppløsning 3,4,9,20,23-28. Men begrenser denne tilnærmingen langsiktig og gjentatt observasjon av kroniske mikrogliaceller endringer, gitt den potensielle risikoen for å forstyrre deres atferd ved selv minimal invasiv hjerneavbildnings prosedyrer 29. Alternativt netthinnen gir optimale forhold for direkte, in vivo visualisering og gjentatt overvåking av mikroglia i sin intakt CNS nisje gjennom aldring, etter akutt skade, ogpotensielt under kroniske nevrodegenerative sykdommer. Dermed har nyere studier vist seg muligheten for høyoppløselig avbildning av netthinnens mikroglia uttrykker GFP ved å tilpasse confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO) til bildet levende CX3CR1 GFP / + mus. Dette har vært brukt til å spore endringer i ukentlige GFP + celleantall i individuelle mus i opp til 10 uker etter akutt indusert skade eller okulær hypertensjon 30-36. Vi har utvidet denne tilnærmingen til å utføre langsiktig bildebehandling over flere måneder, og kvantitativt spore endringer i mikroglia aktivering basert på soma størrelse ved hjelp morfometrisk analyse. Somal størrelse ble definert som en nyttig beregning av mikroglia aktivering i levende bildediagnostikk ved hjelp av to-foton konfokalmikroskopi i kortikale skiver til å utføre in vivo avbildning av CX3CR1-GFP + mikroglia 9. Disse og andre studier viste også sammenhengen mellom Somal størrelse og nivåer av Iba1 protein uttrykk, which øker også med aktivisering 9,37. Således kan aktivert mikroglia identifiseres i levende mus, og deres antall og fordeling overvåkes over tid i løpet av CNS helse og sykdom. Denne protokollen beskriver metoder for cSLO levende bilde oppkjøpet og analyse for å overvåke mikrogliaceller celle tall, distribusjon og morfologiske aktivering under retinal ganglion celle (RGC) degenerasjon (figur 1). Dermed bruker denne studien: 1) en musemodell for arvelig glaukom (DBA / 2J) som gjennomgår aldersavhengig synsnerven og retinal neurodegenerering og viser bemerkelsesverdig variasjon i sykdomsprogresjon mellom 5 og 10 måneders alder 38,39, 2) månedlig cSLO in vivo avbildning for langsiktig visualisering av GFP + celler i netthinnen og unmyelinated synsnerven av heterozygote Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J mus i alderen 3-5 måneder, 3) levende bildeanalyse ved segmentering og thresholding å isolere celle somata og mål denir området. Disse strategiene er brukt for å vurdere kinetikken av netthinnens mikrogliaceller aktiveringstilstander i tidlige stadier av kronisk glaukom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

Mikroglia, som er CNS-resident neuroimmune cellene, omforme deres morfologi og størrelse som svar på CNS skader, bytter til en aktivert tilstand med forskjellige funksjoner og genekspresjonsprofiler. Rollene til microglial aktivering i helse, skade og sykdom forblir ufullstendig forstått på grunn av deres dynamiske og komplekse regulering i respons til endringer i mikromiljøet. Dermed er det viktig å ikke invasiv overvåke og analysere endringer i microglial aktivering over tid i den intakte organisme. In vivo studier av microglial aktivering har blitt forsinket av tekniske begrensninger for å spore microglial atferd uten å endre CNS miljøet. Dette har vært spesielt utfordrende ved kronisk neurodegenerering, der langsiktige endringer må spores. Netthinnen, en CNS organ mottagelig for non-invasiv levende avbildning, tilbyr et kraftig system for å visualisere og karakterisere dynamikken i mikroglia aktivering under kroniske lidelser. in vivo avbildning av retinal microglia, ved hjelp av konfokal ophthalmoscopy (cSLO) og CX3CR1 GFP / + reporter mus, for å visualisere mikroglia med mobilnettet oppløsning. Dessuten beskriver vi metoder for å kvantifisere månedlige endringer i celleaktivering og tetthet i store celleundergrupper (200 til 300 celler pr netthinnen). Vi bekrefter bruk av Somal området som et nyttig beregning for live sporing av microglial aktivering i netthinnen ved å bruke automatiserte terskel-basert morfometrisk analyse av in vivo bilder. Vi bruker disse levende bilde anskaffelse og analyser strategier for å overvåke de dynamiske endringer i microglial aktivering og microgliosis under tidlige stadier av retinal nevrodegenerasjon i en musemodell av kronisk grønn stær. Denne tilnærmingen bør være nyttig å undersøke bidrag fra mikroglia til neuronal og aksonal nedgang i kroniske forstyrrelser i sentralnervesystemet som påvirker netthinnen og synsnerven.

Våre siste in vivo studier brukt disse live image oppkjøpet og analysemetoder for å visualisere og spore kinetikk og mønstre av ONH og retinal mikrogliaceller endringer i tidlige stadier av kronisk glaukom og deres forhold til sent neurodegenerering 59. Her viser vi en cSLO bilde oppkjøpet protokollen for å visualisere mikrogliaceller celler over et stort område av det sentrale netthinnen i enkelte unge heterozygote Cx3CR1-GFP DBA / 2J netthinne (figur 5). Basert på den høye...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma at JoVE.co

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Mikroglia aktivering og microgliosis er viktige svar på kronisk neurodegenerering. Her presenterer vi metoder for in vivo, langsiktig visualisering av netthinnens CX3CR1-GFP + mikrogliaceller cellene ved confocal ophthalmoscopy, og for terskel og morfometrisk analyser for å identifisere og kvantifisere deres aktivering. Vi overvåker mikrogliaceller endringer under tidlige stadier av aldersrelatert glaukom.

In vivo Dynamics of Netthinne mikrogliaceller Aktivering Under Nevrodegenerasjon: Confocal oftalmoskopiske Imaging og Cell morfometri i Mouse Glaukom

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo avbildning av tumor angiogenese med fluoresens Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sekvensiell<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av osteogent Stem / stamceller under brudd Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetri å måle Mouse kontraktile Trykk<em&gt; I Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis av Confocal Optical Imaging<em&gt; I Vivo</em&gt;: En modell av enkelt Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom-induserende prosedyre i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescerende fargemerking av erytrocytter og leukocytter for å studere strømdynamikken i musens retinalsirkulasjon

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...