Name: in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma
Uploaded: 2015-05-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma at JoVE.co

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

In vivo imaging utförs i patogenfria anläggningar som använder protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Utah. OBS: Denna avbildning protokollet används för reporter möss i vilka retinala mikroglia och infiltrerande monocyter / makrofager uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av den fraktalkin receptor lokus (CX3CR1). 1. In vivo avbildning av näthinnan GFP + mikroglia av Confocal Scan...

Realtidsövervakning av microglial cellantal och morfologiska aktivering under en neurodegenerativ sjukdom kräver användning av icke-invasiva avbildningsmetoder som tillåter detaljerad visualisering av cellsärdrag. Efter bildbehandling, måste mikrogliaceller isoleras (segmenterad) för morfometrisk analys genom användning av flera tröskel åtgärder för att bedöma Somal storlek och / eller processkomplexitet som avläsningar för mikroglia aktivering. I detta protokoll, beskriver vi metoder för levande bildtag...

Mikroglia är neuroimmune celler som uteslutande uppehåller sig i det centrala nervsystemet (CNS) sedan början av embryonal utveckling och under hela vuxenlivet. Utrustad med en komplex repertoar av receptorer, är microglial aktivitet och regional heterogenitet regleras av deras dubbelriktad samspel med grann neuroner, Glia, blod-hjärnbarriären och infiltrerande neuroinflammatoriska celler 1,2. Basal microglial funktioner bidrar till fysiologiska underhåll och reparationer, eftersom de prov deras territorium för störningar i homeostasis 3,4. Under CNS-skada eller sjukdom, mikroglia är de första som svarade på neuronala signaler som sedan utlöser övergången till en reaktiv fenotyp, benämnd &quot;aktiverad mikroglia 2,5-7. Mikroglia aktivering involverar en invecklad cykel av gen- och proteinuttryck, vilka är kopplade till cell soma och processstorleksändring och remodeling 6-9. Mikroglia aktivering, liksom omfördelning cell ochklustring, kan åtföljas den lokala totala ökningen av antalet celler (benämnda microgliosis). Detta kan bero på celltillväxt och självförnyelse, med eller utan rekrytering av blodbaserade monocyter 3,4,7,10-14. I ett brett utbud av åldersberoende, kroniska CNS-sjukdomar, ihållande microgliosis och mikroglia aktivering parallell sjukdomsprogression 15-19. Hur mikroglia inverkan neurodegeneration är fortfarande oklart, främst därför att de spelar både neuroprotektiva och skadliga roller som kan ha olika bidrag till sjukdomsdebut och progression. Live imaging studier som syftar till att förstå kronisk CNS-sjukdom har övervakat microglial beteende i den skadade CNS djurmodeller och människor, och visade att microglial förändringar är detekterbara början på stegen 15-17,19,20 tidiga sjukdoms. Därför är det viktigt att utveckla metoder för att upptäcka och övervaka microglial aktivering in vivo. Icke-invasiv deteInsatser av regionala förändringar i hjärnans mikroglia aktivering etablerades som en viktig in vivo indikator på neurodegenerativ sjukdomsprogression, med hjälp av molecular imaging eller bioluminiscens och positronemissionstomografi eller magnetisk resonanstomografi 18,21,22. Dessa mycket kvantitativa och icke-invasiva molekylär och kärnavbildningsmetoder upptäcka gliosis med regional upplösning. Alternativt har två-fotonen konfokala avbildning i CX3CR1 GFP / + möss tillät observation av hjärnans mikroglia med cellulär upplösning 3,4,9,20,23-28. Detta begränsar emellertid långsiktigt tillvägagångssätt och upprepad observation av kroniska mikrogliaceller förändringar, med tanke på den potentiella risken för att störa deras beteende genom att även minimalt invasiva hjärnavbildningsförfaranden 29. Alternativt erbjuder näthinnan optimala förutsättningar för direkt, in vivo visualisering och upprepad övervakning av mikroglia i deras intakt CNS nisch hela åldrande, efter akut skada, ochpotentiellt under kroniska neurodegenerativa sjukdomar. Således har nya studier visat genomförbarheten av högupplösta avbildning av retinala mikroglia uttrycker GFP genom att anpassa konfokala scanning laser ophthalmoscopy (cSLO) bilden levande CX3CR1 GFP / + möss. Detta har använts för att spåra varje vecka förändringar i GFP + cellantal i individuella möss i upp till 10 veckor efter akut inducerad skada eller okulär hypertension 30-36. Vi har utökat denna metod för att utföra långsiktiga avbildning under flera månader, och kvantitativt spåra ändringar i mikroglia aktivering baserat på soma storlek använder morfometrisk analys. Somal storlek definierades som en användbar metriska av mikroglia aktivering i levande imaging studier med två-foton konfokalmikroskopi i kortikala skivor för att utföra in vivo avbildning av CX3CR1-GFP + mikroglia 9. Dessa och andra studier visade också sambandet mellan Somal storlek och halter av Iba1 proteinuttryck, which ökar också med aktivering 9,37. Således kan aktiveras mikroglia identifieras i levande möss, och deras antal och distribution övervakas under tiden under CNS hälsa och sjukdom. Detta protokoll beskriver metoder för cSLO sökarbilden insamling och analys för att övervaka microglial cellantal, distribution och morfologisk aktivering under näthinneganglieceller (RGC) degeneration (Figur 1). Således använder denna studie: 1) en musmodell av ärftlig glaukom (DBA / 2J) som genomgår åldersberoende synnerven och retinal neurodegeneration och visar anmärkningsvärd variation i sjukdomsförloppet mellan 5 och 10 månaders ålder 38,39, 2) månads cSLO in vivo imaging för långsiktig visualisering av GFP + celler i näthinnan och omyeliniserad synnerven av heterozygota CX3CR1 GFP / + DBA / 2J möss åldern 3-5 månader, 3) levande bildanalys genom segmentering och tröskel att isolera cell somata och åtgärd denir område. Dessa strategier används för att bedöma kinetiken av näthinnans microglial aktiveringstillstånd under tidiga stadier av kronisk glaukom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

Mikroglia, som är CNS-bosatta neuroimmune celler, förändra deras morfologi och storlek som svar på CNS-skada, byta till ett aktiverat tillstånd med tydliga funktioner och genuttrycksprofilerna. Roller microglial aktivering i hälsa, skada och sjukdom fortfarande ofullständigt känd på grund av deras dynamiska och komplexa reglering som svar på förändringar i deras mikromiljö. Därför är det viktigt att icke-invasivt övervaka och analysera förändringar i microglial aktivering över tiden i den intakta organismen. In vivo studier av microglial aktivering har försenats av tekniska begränsningar att spåra microglial beteende utan att ändra CNS miljön. Detta har varit särskilt utmanande under kronisk neurodegeneration, där långsiktiga förändringar måste spåras. Näthinnan, en CNS organ mottagliga för icke-invasiv levande avbildning, erbjuder ett kraftfullt system för att visualisera och karakterisera dynamiken i mikroglia aktivering under kroniska sjukdomar. in vivo imaging av retinal mikroglia, med hjälp av konfokal ophthalmoscopy (cSLO) och CX3CR1 GFP / + reporter möss, för att visualisera mikroglia med cellulär upplösning. Dessutom beskriver vi metoder för att kvantifiera månatliga förändringar i cellaktivering och täthet i stora cellgrupper (200-300 celler per näthinnan). Vi bekräftar användningen av Somal område som ett användbart mått för levande spårning av microglial aktivering i näthinnan genom att tillämpa automatiserad tröskel baserade morfometrisk analys av in vivo bilder. Vi använder dessa sökarbilden förvärv och analyserar strategier för att övervaka de dynamiska förändringar i microglial aktivering och microgliosis under tidiga stadier av retinal neurodegeneration i en musmodell för kronisk glaukom. Detta tillvägagångssätt bör vara användbara för att undersöka bidragen från mikroglia till neuronala och axonal nedgång i kroniska sjukdomar i centrala nervsystemet som påverkar näthinnan och synnerven.

Våra senaste in vivo-studier använt dessa levande bild förvärv och analysmetoder för att visualisera och spåra kinetik och mönster av ONH och retinala microglial förändringar under tidiga stadier av kronisk glaukom och deras förhållande till slutet av neurodegeneration 59. Här visar vi en cSLO bildtagning protokoll för att visualisera mikrogliaceller över ett stort område i den centrala näthinnan i enskilda unga heterozygota CX3CR1-GFP DBA / 2J näthinnor (Figur 5). B...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma at JoVE.co

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Mikroglia aktivering och microgliosis är viktiga svar på kronisk neurodegeneration. Här presenterar vi metoder för in vivo långsiktig visualisering av näthinnan CX3CR1-GFP + mikrogliaceller genom konfokal oftalmoskopi, och för tröskel och morfometriska analyser för att identifiera och kvantifiera deras aktivering. Vi följer microglial förändringar under tidiga stadier av åldersrelaterade glaukom.

In vivo Dynamisk av näthinnan microglial Aktivering Under neurodegeneration: Confocal oftalmoskopiska Imaging och Cell morfometri i mus Glaukom

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon avbildning av tumörcellen invasion i ett Orthotopic musmodell av oral skivepitelcancer

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo bioluminescence avbildning av tumör Hypoxi Dynamics i bröstcancer metastaser i hjärnan i en musmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo avbildning av blodkärl i tumören med hjälp av fluorescens Confocal videomikroskopi

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI för Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sekventiell<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Osteogena Stem / progenitorceller Under Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetry att mäta Mouse kontraktila Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis av Confocal optisk avbildning<em&gt; In Vivo</em&gt;: En modell av enda kärl Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom framkallande ordningen i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Råttmodell och Hela montering Retina Förberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescerande färgämnesmärkning av erytrocyter och leukocyter för att studera flödesdynamiken i muskelspiralcirkulationen

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...