Name: two-photon imaging of intracellular ca2+ handling and nitric oxide production in endothelial and smooth muscle cells of an isolated rat aorta
Uploaded: 2015-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta at JoVE.com

Nous remercions le Dr William Cashdollar, et le Centre Foundation Imaging Northwestern Mutual à l&#39;Institut de recherche de sang du Wisconsin de l&#39;aide pour les études d&#39;imagerie. Nous remercions également le Dr Daria Ilatovskaya pour la lecture critique de ce manuscrit et de discussion utile. Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health des subventions HL108880 (AS) et DP2-OD008396 (à AMG).

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) au Collège médical du Wisconsin et étaient en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Isolement de l&#39;aorte Rat <ol><li> Anesthésier rats avec de l&#39;isoflurane (5% induction, 1,5 à 2,5% maintenance) ou d&#39;une autre méthode IACUC approuvé...

<ol>
	<li>Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+2-photon+microscopy+to+understand+albuminuria.">Using 2-photon microscopy to understand albuminuria.</a> Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).</li><li>Burford, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+podocyte+calcium+in+glomerular+injury+and+disease.">Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease.</a> J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H(2)O(2)+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+analysis+and+calcium+imaging+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated.">Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated.</a> J Vis. Exp. In Press, (2015).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+superoxide+and+angiotensin+II+suppression+in+salt-induced+changes+in+endothelial+Ca2++signaling+and+NO+production+in+rat+aorta.">Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).</li><li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Plekha7+attenuates+salt-sensitive+hypertension+in+the+rat.">Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318, 558-561 (1985).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastin+network:+its+relationship+with+collagen+and+cells+in+articular+cartilage+as+visualized+by+multiphoton+microscopy.">The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy.</a> J. Anat. 215, 682-691 (2009).</li><li>Sathanoori, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+endothelial+KLF2+through+activation+of+P2X4.">Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4.</a> Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).</li><li>Hall, A. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Multiphoton+Microscopy:+Focusing+Light+on+Acute+Kidney+Injury.">Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury.</a> Physiology. 29, 334-342 (2014).</li><li>Campese, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity+in+hypertension.+Renal+and+cardiovascular+implications.">Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications.</a> Hypertension. 23, 531-550 (1994).</li><li>Cowley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+salt+sensitivity+and+blood+pressure.">Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure.</a> Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypertension+susceptibility+loci+on+rat+chromosome+12.">Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12.</a> Hypertension. 60, 942-948 (2012).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+multiple+causative+genes+at+a+single+GWAS+locus.">Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus.</a> Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).</li><li>Mattson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mutation+of+recombination+activating+gene+1+in+Dahl+salt-sensitive+rats+attenuates+hypertension+and+renal+damage.">Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).</li><li>Rudemiller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD247+modulates+blood+pressure+by+altering+T-lymphocyte+infiltration+in+the+kidney.">CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney.</a> Hypertension. 63, 559-564 (2014).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment.">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li></ol>

Présentation expérimentale. Pour mieux comprendre la contribution de calcium et NON à la physiologie vasculaire, une nouvelle méthode a été développée pour mesurer [Ca 2+] i et de NO dans les cellules musculaires lisses et endothéliales des aortes intactes isolées. Ensemble, ce protocole se compose de ces étapes critiques: 1) l&#39;isolement et la préparation mécanique (digestion enzymatique pas) du navire. Il est important de garder le tissu sain et intact autant que possible...

Le calcium est un second messager fondamental à l&#39;intérieur de cellules vasculaires tels que des cellules endotheliales et des muscles lisses. Il est le stimulus primaire pour la contraction vasculaire et joue un rôle majeur dans la dilatation vasculaire, y compris ses effets par le biais de la production de NO dans le endothélium. En raison des limites des technologies d&#39;imagerie, il a été pratiquement impossible d&#39;observer la manipulation de calcium dans le récipient intact. Le développement de deux systèmes d&#39;imagerie photonique et la création de nouvelles calcium ou pas de colorants d&#39;étiquetage, il est possible de l&#39;image à une profondeur et une résolution suffisantes pour commencer à comprendre la dynamique de calcium et la production de NO dans le système vasculaire. La microscopie à deux photons a récemment été appliquée dans les tissus, les organes et les études sur les animaux entiers, même en raison de sa capacité supérieure pour pénétrer profondément les tissus à faible fluorescence de fond et de la sensibilité du signal haute. 1,2 Le spectre étroit de deux excitation photonique au illumination point focal et l&#39;utilisation de détecteurs non-descanned sont les raisons pour lesquelles les deux microscopie photon est supérieure à la microscopie confocale traditionnelle. La microscopie confocale ne peut pas produire des images de haute qualité à la profondeur de tissu nécessaire en raison de l&#39;auto-fluorescence et la diffusion de la lumière hors-focus dans le sténopé confocal. Par conséquent, nous avons développé une méthode utilisant un microscope à deux photons pour mesurer [Ca 2+] i la signalisation et la production de NO dans les cellules intactes, individuels des vaisseaux sanguins avec une résolution élevée et un faible rapport signal sur bruit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DAF-FM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-23842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo 4 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F14217</td>
			<td>500&#181;l in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Name</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP DeepSee-OL&#160;</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser 690nm &#8212; 1040nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10-MRL/R&#160;</td>
			<td>495 to 540 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25&#215; water-immersion objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPL25XWMP</td>
			<td>N.A. 1.05 and working distance 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Anchor grid&#160;</td>
			<td>Warner Instrument&#160;</td>
			<td>SHD-27LH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other basic reagents&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of intracellular ca2+ handling and nitric oxide production in endothelial and smooth muscle cells of an isolated rat aorta

Le calcium est un régulateur important de nombreux processus physiologiques dans les tissus vasculaires. La plupart des fonctions endothéliales et musculaires lisses dépendent fortement des changements de calcium intracellulaire ([Ca 2+] i) et de l&#39;oxyde nitrique (NO). Afin de comprendre comment [Ca 2+] i, NO et des molécules en aval sont traitées par un vaisseau sanguin en réponse à des vasoconstricteurs et vasodilatateurs, nous avons développé une nouvelle technique qui applique calcium-étiquetage (ou NO-étiquetage) colorants comportant deux microscopie photonique à mesurer la manipulation de calcium (ou de la production de NO) dans les vaisseaux sanguins isolés. Décrit ici est une procédure détaillée étape par étape qui montre comment isoler une aorte d&#39;un rat, l&#39;étiquette de calcium ou de NO dans les cellules endothéliales ou musculaires lisses, et l&#39;image transitoires de calcium (ou la production de NO) à l&#39;aide d&#39;un microscope à deux photons suivante physiologique ou des stimuli pharmacologiques. Les avantages de l&#39;utilisation de la méthode sont multiples: 1) il est possible d&#39;simultanély mesurer les transitoires de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses en réponse à différents stimuli; 2) elle permet de cellules endotheliales de l&#39;image et des cellules musculaires lisses dans leur milieu d&#39;origine; 3) cette méthode est très sensible au calcium intracellulaire ou pas de changements et génère des images à haute résolution pour des mesures précises; et 4) approche décrite peut être appliquée à la mesure d&#39;autres molécules, telles que les espèces réactives de l&#39;oxygène. En résumé, l&#39;application de deux microscopie biphotonique d&#39;émission laser pour contrôler les transitoires de calcium et la production de NO dans les endothéliales et musculaires lisses des cellules d&#39;un vaisseau sanguin isolé a fourni des données quantitatives de haute qualité et de la promotion de notre compréhension des mécanismes de régulation de la fonction vasculaire.

Afin d&#39;évaluer avec précision la contribution de calcium à la physiologie vasculaire (vasodilatation et la vasoconstriction), un protocole a été conçu pour charger colorants de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses dans isolé aorte intacte. Le dispositif expérimental général mis en place le montre la figure 1, montre la stratégie de base pour l&#39;isolement et la préparation du navire avant l&#39;imagerie. Brièvement, après isolement de l&#39;aort...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta at JoVE.com

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Recherche

Biologie

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

L&#39;isolement de l&#39;homme de l&#39;artère ombilicale cellules musculaires lisses (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Mesure de la fonction musculaire lisse dans les tissus isolés Bath-applications à la pharmacologie de recherche

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En détection de visage de l&#39;oxyde nitrique et de superoxyde dans la couche endothéliale des artères intactes

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Blessure à la gorge aortique murine: une efficacité<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de prolifération des cellules musculaires lisses et fonction endothéliale

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...