Name: concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration
Uploaded: 2015-04-03T15:00:00
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저자는 중요한 토론 W. 일 및 K. 젠슨 감사, 싱가포르 국립 대학의 나노 역학 연구소의 지원을 인정합니다. NAK는 마리 퀴리 IIF 원정대에 의해 지원을 인정합니다.

1. 세포 수확 <ol><li> 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 MD-MBA-231 세포를 얻습니다. 0.5 % 트립신 - EDTA 용액을 이용하여 조직 배양 접시에서 세포를 분리합니다. T25 플라스크에서 배양 세포 트립신 EDTA 용액 1 ㎖를 사용합니다. </li><li> 4 분의 200 × g에서 원심 분리하여 15ml의 원뿔형 튜브 펠렛의 세포 상등액을 흡인하고, 세포를 재현 탁 배양액 5ml에. </li><li> 혈구를 사용하여, ρ, 셀 밀도를 계산. <...

<ol>
	<li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+three-dimensional+collagen+matrices+to+provide+contact+guidance+during+3D+cell+migration.">Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration.</a> Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).</li><li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+dimensions+in+cell+migration.">New dimensions in cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).</li><li>Grinnell, F., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration.">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li><li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering:+the+effects+of+pH,+temperature+and+ionic+strength+on+gelation.">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li><li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments.">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+limits+of+cell+migration:+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force.">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration:+a+mechanistic+perspective.">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices.">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li><li>Mouw, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression.">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres.">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li><li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration.">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

세포의 이주는 배아 발달, 지혈, 면역 응답으로서뿐만 아니라, 혈관 질환, 염증, 암과 같은 병리학 한 공정에서 다양한 생리 학적 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 이동의 기초 생화학 및 생물 물리학 적 요인을 해부하여 세포 기능의 기본 원리를 이해뿐만 아니라, 조직 공학, 안티 전이 및 항 염증성 약물 개발 등 다양한 생물 의학 응용 프로그램을 전진뿐만 따라서 근본적으로 중요하다. 생체 관측 기술적 도전이기 때문에, 많은 노력은 세포 이동의 시험관 재현부에 집중되어왔다. 세포의 이동을 연구하는 체외 방법에서 크게 특히, 두 개의 차원 (2D) 표면 분석을위한 스크래치를 설계 또는 분석이 상처 치유되었습니다. 이러한 분석은 간단한 실험 장치를 제공, 쉬운 가축세포 이미징 및 세포 이동의 기초가 다양한 생화학 적 메커니즘에 유용한 통찰력을 제공한다. 그러나 이러한 분석은 생체 마이그레이션에 대한 이해의 중요한 측면이다 세포 외 기질 (ECM) 건축과 리모델링을 고려하지 않습니다. 최근에는 점차 3D 배양 모델은 종종 콜라겐 계 매트릭스 3에서, 더 나은 상황 생체 유사한 플랫폼을 제공하는 것이 이해되었다. 실제로, 세포는 특히 인해 환경 (4)의 다른 차원을 2 차원 표면에 나타나는 것과 구별되는 migrational 동성을 나타낸다. 더욱이, 행렬의 생물 리 학적 및 기계적 특성을 민감하게 종양 세포 침윤 (6)의 컨텍스트에 포함하여, 세포 이동 (5)에 영향을 미친다. 여기서, 우리는 제조 조건에서 쉽게 변할 수 생물 리 학적 특성을 갖는 ECM 차원 셀 마이그레이션 동작을 연구하는 방법을 제시한다. 세포는 아르&quot;내부 젤&quot;의 시드와로 새어 처음에 무 세포 &quot;외부 젤을&quot;침략 수 있습니다. 상기 방법은 세포가 밀접 7 mechanosensing 연결되어 외측 겔에서 무 세포 지역으로 이동하는 세포의 존재를 인식 할 수있는 능력, 및 성향에 의존한다. 이 연구에서 우리는 매우 침습적 유방암 세포, MD-MBA-231에 의해 침략 ECM의 콜라겐 네트워크를 사용합니다. 기계적 특성 모두 내측 및 외측 겔의 미세 조정 8 및 생리 학적으로 관련된 조건을 달성하기 위해 구를 특징으로 할 수있다. 셀 트랙의 재건 및 분석은 인구 수준 및 개별 셀 레벨 모두에서 시공간 마이그레이션 동작의 상세한 정량적 검사를 할 수 있습니다. 중요한 것은, 동심 젤 시스템의 설치, 따라서 중요한 통찰력을 제공하고, 특히 암 세포에 침입, 세포 마이그레이션 직면 한 생체 조직 토폴로지를 모방세포 이동 및 전이의 물리적 메커니즘.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Fisher Scientific Pte Ltd</td>
			<td>Model: 371, S/No 318854-6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td></td>
			<td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C2927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dish</td>
			<td>IWAKI Cell Biology</td>
			<td>3931-035</td>
			<td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iN CYTO</td>
			<td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>pH 211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>#5010-D</td>
			<td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S/No 29153352</td>
			<td>Basic pH Meter PB-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

이동하는 세포의 능력은 암 및 암전이에에서 배아 발생 및 상처 치유 수명에 걸쳐 세포 기능의 다양한 중요하다. 강렬한 연구 노력에도 불구하고, 세포 이동의 기본 생화학 및 생물 물리학 적 원리는 아직도 완전히 특히 생리 관련 3 차원 (3D) 미세 환경에서 이해되지 않습니다. 여기서는 3D 세포 이동 동작의 정량적 검사가 가능하도록 설계 시험 관내 분석을 기술한다. 이 방법은 이전에 빈 세포 외 기질 (ECM)로 마이그레이션하는 세포의 mechanosensing 능력과 성향을 이용한다. 우리 모델 시스템으로서 콜라겐 겔에서 고도로 침윤성 유방암 세포의 침윤, MDA-MB-231을 사용한다. 주 동안 배양 세포 집단의 확산 및 개별 세포의 이주 역학 라이브 세포 이미징을 사용하여 모니터링 및 시공간 - 분해 된 데이터를 추출하기 위해 분석 될 수있다. 게다가상기 방법에 따라서 세포 이동에 생물 물리학 적 미세 인자의 역할을 조사하기 간단하지만 강력한 방법을 제공하고, 다양한 세포 외 기질을위한 용이하게 적응할 수있다.

여기에 제시된 동심 겔 분석 고도로 침윤성 유방암 세포를 사용하여 수행하고, MDA-MB-231, 2.4 ㎎ / ml의 내측 콜라겐 젤, 예로서 = 2 × 106 세포 / ml의 세포 시딩 밀도와. 도 2에 도시 된 바와 같이, 통상적으로 배양 몇 일 후, 세포 내외 겔 인터페이스를 위반하고 외측 겔 침투하기 시작했다. 셀 인구는 반경 방향 바깥쪽으로 주로 확산. 외측 겔 중합 조건은 세포...

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Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...