Name: analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00
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N.G.是法国"法国重建基金会"和菲利普基金会的奖学金获得者;R.S. 由露西尔·帕卡德儿童健康基金会和斯坦福NIH/NCRR CTSA奖号码UL1 RR025744支持;P.S. 得到马克斯·卡德基金会和奥地利科学院的马克斯·卡德研究金和奥地利科学基金（FWF）施罗德研究金的支持：J3399-B21：S.J.G. 承认来自国家卫生研究院的支持，资助 U19 AI104209、NS 080062 和加州大学烟草相关疾病研究计划;L.L.R. 承认关节炎国家研究基金会 （ANRF） 和国家卫生研究院资助 K99AI110645。

所有动物护理和实验都是按照国家卫生研究院的指导方针和斯坦福大学动物护理和使用机构委员会的具体批准进行的。
1. 骨髓衍生培养乳腺细胞（BMCMCs）的生成和特征。
注意：捐赠者BMCMC应该来自与接受MC缺乏小鼠具有相同遗传背景的骨髓细胞。雄性供体BMCMC不适合雌性小鼠的移植。女性衍生的捐赠者BMCMC将成功地融入男性和女性接受者。
<ol><li>骨髓提?...

在最初的描述38年之后的近30年，"桅杆细胞敲击"方法继续提供有价值的信息，说明MC在体内可以做什么或不能做什么。长期以来，人们一直认为MC的功能仅限于它们在过敏症中的作用。使用"桅杆细胞敲击"方法生成的数据改变了这一观点，通过提供证据，证明MC除了其他功能外，可以在宿主防御某些病原体4，39或毒气28，31方面发挥关键作用，甚至可以抑?...

乳腺细胞（MCs）是由多能骨髓祖先1-3产生的造血细胞。骨髓外泄后，MCs祖先迁移到各种组织，在当地生长因子1-3的影响下发育成成熟的MC。组织驻地MC战略性地位于主机环境界面，如皮肤、气道和胃肠道，它们作为抵御外部侮辱的第一道防线。MCs 通常根据其"基线"表型特征及其解剖位置进行子分类。在小鼠中，有两种类型的MC被描述："结缔组织型"MC（CTMC）和粘体MC（MMCs）1-3，7，8。CTMC通常位于静脉注射器和神经纤维附近，并居住在血清腔中，而MMC在肠道和呼吸粘膜1-3中占据腹腔内位置。
研究9-13年MC的生物功能，已应用多种方法。许多小组都专注于使用细胞系的体外方法（如人类MC线HMC114或LAD215，16）、体外衍生MC（如人类外周血源性MC17，或小鼠骨髓衍生） 培养的MC [BMCMCs]18，胎儿皮肤衍生MC [FSCMCs]19和腹腔细胞衍生MC [PCMC]20）或来自不同解剖站点的前体内分离的MC。所有这些模型被广泛用于研究MC生物学的分子细节，例如MC激活中涉及的信号通路。然而，MCs生物学的一个重要方面是，它们的表型和功能特征（如细胞质颗粒蛋白酶含量或对不同刺激的反应）可以通过解剖位置和微环境2，7进行调节。由于在体内遇到的这些因素的确切混合物可能很难在体外繁殖，我们赞成使用体内方法来深入了解MC功能9。
存在一些具有遗传 MC 缺陷的小鼠菌株，例如广泛使用的 WBB6F1-套件W/W-v或 C57BL/6-套件W-sh/W-sh小鼠。这些小鼠缺乏KIT（CD117）的表达和/或活性，KIT是主要MC生长因子干细胞因子（SCF）21，22的受体。因此， 这些小鼠有一个深刻的MC缺陷，但也有额外的表型异常有关他们的c-套件突变（在WBB6F1-套件W/W-v小鼠）或大染色体反转的影响，导致减少c-套件表达（在C57BL/6-套件W-sh/W-sh小鼠）9，10，12，23。最近，一些具有c-套件独立构成MC缺乏症的小鼠株被报告为24-26。所有这些小鼠和一些额外的新型诱导MC缺陷小鼠最近已详细审查9，10，13。
在这里，我们描述了小鼠骨髓衍生培养MC（BMCMCs）的生成方法，它们被收养转移到缺乏MC的老鼠，以及不同解剖部位对收养转移的MC的数量和分布的分析。这种所谓的 "桅杆细胞敲击" 方法可用于评估MC和MC衍生产品 在体内的功能。我们根据近年来开发的替代方法讨论了这种方法的优点和局限性。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

乳腺细胞 （MCs） 是存在于各种组织的造血细胞，在暴露于外部环境（如皮肤、气道和胃肠道）的部位尤为丰富。以在IgE依赖过敏反应中的有害作用而闻名的MC也成为主机防御毒液和入侵细菌和寄生虫的重要参与者。MC表型和功能可能受微环境因素的影响，微环境因素可能因解剖位置和/或根据免疫反应的类型或阶段而异。因此，我们和其他人 倾向于在体内 方法而不是 体外方法， 以获得对MC函数的洞察。在这里，我们描述了小鼠骨髓衍生培养MC（BMCMCs）的生成方法，它们被收养转移到基因缺MC的小鼠，以及不同解剖部位对收养转移的MC的数量和分布的分析。这种方法，被称为"桅杆细胞敲击" 的方法，已经广泛使用在过去30年评估MC和MC衍生产品的 功能在体内。我们根据近年来开发的替代方法讨论了这种方法的优点和局限性。

图1中概述了"桅杆细胞敲击"方法，包括BMCMCs的生成、应移植到缺MC小鼠体内的细胞数量（如果根据实验设计指示，数量可以有所变化）和根据注射部位的增殖和实验之间的间隔（如果指示，此间隔也可能有所不同：例如，MC细胞质颗粒中存储的调解员的内容随着时间的增加而稳步增加。图2显示DMEM介质中含有20%WEHI-3细胞条件介质作为IL-3来源的具有代表...

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Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

我们描述了体 外 衍生桅杆细胞的生成方法，它们被移植到乳腺细胞缺乏的小鼠中，以及不同解剖部位对网状桅杆细胞的表型、数量和分布的分析。此协议可用于评估桅杆细胞 在体内的功能。

使用"桅杆细胞敲击"小鼠分析体内桅杆细胞的功能

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

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在细胞命运<em&gt; E.大肠杆菌</em感染后的噬菌体λ

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

科研

免疫与感染

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

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移植物抗宿主病的诱导和<em在体内</em&gt; T细胞监测中的应用MHC匹配的小鼠模型

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

微孔板的检测，以评估RBL-2H3肥大细胞脱颗粒：三氯生的影响不使用有机溶剂的化学效应

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Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

调查肥大细胞分泌颗粒;从合成到胞吐作用

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Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

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