Name: analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

N.G. modtager stipendier fra den franske "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" og Philipp Foundation; R.S. støttes af Lucile Packard Foundation for Children's Health og Stanford NIH/NCRR CTSA award number UL1 RR025744; PS støttes af et Max Kade Fellowship fra Max Kade Foundation og det østrigske videnskabsakademi og et Schroedinger Fellowship fra den østrigske videnskabsfond (FWF): J3399-B21; SJ G. anerkender støtte fra National Institutes of Health tilskud U19 AI104209, NS 080062 og fra Tobaksrelaterede Sygdomme Research Program ved University of California; L.L.R. anerkender støtte fra Arthritis National Research Foundation (ANRF) og National Institutes of Health grant K99AI110645.

Al dyrepleje og -forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health og med den specifikke godkendelse af Institutional Animal Care and Use Committee fra Stanford University.
1. Generering og karakterisering af knoglemarvsbaserede kulturperler (BMCMCs).
Bemærk: Donor BMCMCs bør genereres fra knoglemarvsceller med samme genetiske baggrund som modtageren MC-mangelfuld mus. Mandlige donor BMCMCs er ikke egnede til engraftment ...

Næsten 30 år efter den første beskrivelse38, den 'mast celle knock-in' tilgang fortsætter med at give værdifulde oplysninger om, hvad MCs kan gøre eller ikke kan gøre in vivo. De funktioner, MCs var længe menes at være begrænset til deres rolle i allergi. Data genereret ved hjælp af 'mast celle knock-in' tilgang har ændret denne opfattelse, ved at fremlægge bevis for, at MCs kan blandt andre funktioner, spille kritiske roller i værtsforsvaret mod visse patogener4,3...

Mastceller (MCs) er hæmatopoietiske celler, der opstår fra pluripotente knoglemarvs forfædre1-3. Efter knoglemarvsudstridelse migrerer MCs-forfædre ind i forskellige væv, hvor de udvikler sig til modne MCs under indflydelse af lokale vækstfaktorer1-3. Vævsbeboende MCs er strategisk placeret på værtsmiljøgrænseflader, såsom huden, luftvejene og mave-tarmkanalen, hvor de opfører sig som en første forsvarslinje mod eksterne fornærmelser3-6. MCs er ofte subklassificeret baseret på deres "baseline" fænotypiske egenskaber og deres anatomiske placeringer. Hos mus er der beskrevet to typer MC'er: "bindevævstype" MCs (CTMCs) og slimhinde-MCs (MMCs)1-3,7,8. CTMCs er ofte placeret omkring venules og nær nervefibre, og bor i serosale hulrum, mens MMCs indtager intraepithelial steder i tarmen og respiratorisk slimhinde1-3.
Talrige metoder er blevet anvendt til at studere biologiske funktioner af MCs9-13. Mange grupper har fokuseret på in vitro tilgange ved hjælp af enten cellelinjer (såsom den menneskelige MC linjer HMC114 eller LAD215,16), in vitro afledte MC (såsom menneskelige perifere blod-afledte MC17, eller mus knoglemarv-afledt kultur18, føtal hudafledte dyrkede MC'er [FSCMCs]19 og peritoneale cellebaserede MCs [PCMCs]20) eller ex vivo isolerede MCS fra forskellige anatomiske steder. Alle disse modeller er meget udbredt til at studere molekylære detaljer i MC biologi, såsom signalering veje involveret i MC aktivering. Et vigtigt aspekt af MCs biologi er imidlertid, at deres fænotypiske og funktionelle egenskaber(f.eks.cytoplasmisk granulatproteaseindhold eller reaktion på forskellige stimuli) kan moduleres ved anatomisk placering og mikromiljø2,7. Da den nøjagtige blanding af sådanne faktorer, der opstår in vivo, kan være vanskelig at reproducere in vitro, går vi ind for at bruge in vivo-tilgange til at få indsigt i MCs-funktioner9.
Der findes flere musestammer med genetisk MC-mangel, såsom de udbredte WBB6F1-Kit W/W-v eller C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mus. Disse mus mangler udtryk og/eller aktivitet af KIT (CD117), receptoren for den vigtigste MC vækstfaktor stamcellefaktor (SCF)21,22. Som følge heraf har disse mus en dyb MC-mangel, men har også yderligere fænotypiske abnormiteter relateret til deres c- kit-mutationer (i WBB6F1-Kit W/ W-v mus) eller til virkningerne af den store kromosomale inversion, der resulterer i reduceret c-kit-udtryk (i C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mus) 9,10,12,23. For nylig er flere stammer af mus med c-kit-uafhængigkonstituerende MC-mangel blevet rapporteret24-26. Alle disse mus og nogle yderligere nye typer af inducible MC-mangelfulde mus er for nylig blevet gennemgået i detaljer9,10,13.
Her beskriver vi metoder til generering af mus knoglemarv-afledte dyrkede MC'er (BMCMCs), deres adoptivoverførsel til MC-mangelfuld mus, og analysen af antallet og fordelingen af adoptiv-overførte MC'er på forskellige anatomiske steder. Denne såkaldte "mastcelle knock-in"-metode kan bruges til at vurdere MCs og MC-afledte produkter in vivo. Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved denne metode i lyset af alternative tilgange, der er blevet udviklet i de senere år.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Mastceller (MCs) er hæmatopoietiske celler, der findes i forskellige væv, og er især rigelige på steder, der udsættes for det ydre miljø, såsom hud, luftveje og mave-tarmkanalen. Bedst kendt for deres skadelige rolle i IgE-afhængige allergiske reaktioner, har MCs også vist sig som vigtige aktører i værtsforsvaret mod gift og invaderende bakterier og parasitter. MC-fænotype og -funktion kan påvirkes af mikromiljøfaktorer, der kan variere afhængigt af anatomisk placering og/eller baseret på typen eller udviklingsstadiet for immunrespons. Af denne grund har vi og andre begunstiget in vivo tilgange over in vitro metoder til at få indsigt i MC funktioner. Her beskriver vi metoder til generering af mus knoglemarvs-afledte dyrkede MC'er (BMCMCs), deres adoptivoverførsel til genetisk MC-mangelfuld mus, og analysen af antallet og fordelingen af adoptiv-overførte MC'er på forskellige anatomiske steder. Denne metode, der kaldes"mast celle knock-in"-metoden, er blevet anvendt i vid udstrækning i løbet af de sidste 30 år til at vurdere MCs og MC-afledte produkter in vivo. Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved denne metode i lyset af alternative tilgange, der er blevet udviklet i de senere år.

En oversigt over metoden 'mastcelle knock-in' er vist i figur 1og omfatter generering af BMCMCs, antallet af celler, der skal indpodes i.p., i.d. eller i.v. i MC-mangelfulde mus (antallet kan varieres, hvis det er angivet på grundlag af forsøgsdesignet) og intervallet mellem engraftment og eksperiment afhængigt af injektionsstedet (dette interval kan også variere, hvis det er angivet; f.eks.øges indholdet af lagrede mæglere i MC cytoplasmiske granulater støt med tiden38</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Vi beskriver en metode til generering af in vitro-afledte mastceller, deres engraftment i mastcelle-mangelfulde mus og analyse af fænotypen, antal og fordeling af engrafterede mastceller på forskellige anatomiske steder. Denne protokol kan bruges til at vurdere mastcellernes funktioner in vivo.

Analyse af mastcellernes funktioner i Vivo Ved hjælp af 'Mast Cell Knock-in' Mus

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion af graft-versus-host sygdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell Monitoring Brug en MHC-matchet murin model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En Microplade Assay til vurdering af kemiske Virkninger på RBL-2H3 mastcelledegranulering: Effekter af Triclosan uden brug af et organisk opløsningsmiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Undersøgelse Mast Cell Sekretorisk Granulat; fra Biosyntese til exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdering Retinal mikrogliaceller fagocytotisk funktion<em&gt; In vivo</em&gt; Brug en flowcytometri-baseret assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolering af bughinden-afledte mastceller og deres funktionelle karakterisering med Ca2 +-billedbehandling og degranulering Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering af Thymus-afhængige og Thymus-uafhængig Immunoglobulin Isotype svar i mus ved hjælp af enzym-forbundet Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Generation af Knock-out primære og udvidet menneskelige NK celler ved hjælp af Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Adoptivimmunterapi af iNKT-celler i glucose-6-fosfatisomerase (G6PI)-Induceret RA-mus

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Evaluering af T Follikulære Hjælpeceller og Germinal Center Response Under Influenza A Virus Infektion i Mus

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...