Name: analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

N.G. is de ontvanger van beurzen van de Franse "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" en de Philipp Foundation; R.S. wordt ondersteund door de Lucile Packard Foundation for Children's Health en het Stanford NIH/NCRR CTSA award nummer UL1 RR025744; P.S. wordt ondersteund door een Max Kade Fellowship van de Max Kade Foundation en de Austrian Academy of Sciences en een Schroedinger Fellowship van het Austrian Science Fund (FWF): J3399-B21; S.J.G. erkent steun van National Institutes of Health grants U19 AI104209, NS 080062 en van Tobacco-Related Disease Research Program aan de Universiteit van Californië; L.L.R. erkent steun van de Arthritis National Research Foundation (ANRF) en National Institutes of Health grant K99AI110645.

Alle dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en met de specifieke goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van Stanford University.
1. Generatie en karakterisering van van beenmerg afgeleide gekweekte mestcellen (BMCMCs).
Opmerking: Donor BMCMCs moeten worden gegenereerd uit beenmergcellen met dezelfde genetische achtergrond als de ontvangende MC-deficiënte muiz...

Bijna 30 jaar na de oorspronkelijke beschrijving38blijft de'mast cell knock-in '-benaderingwaardevolle informatie verschaffen over wat MC 's wel of niet in vivokunnen doen . Lang werd gedacht dat de functies van MC's beperkt waren tot hun rol bij allergie. Gegevens die zijn gegenereerd met behulp van de'mast cell knock-in'-benaderinghebben deze visie veranderd, door bewijs te leveren dat MC's onder andere een cruciale rol kunnen spelen in de verdediging van de gastheer tegen bepaalde...

Mastcellen (MC's) zijn hematopoëtische cellen die ontstaan uit pluripotente beenmergfgenitatoren1-3. Na uitzetting van het beenmerg migreren MCs-voorlopers naar verschillende weefsels waar ze zich ontwikkelen tot volwassen MC's onder invloed van lokale groeifactoren1-3. Tissue-resident MC's bevinden zich strategisch op host-omgeving interfaces, zoals de huid, de luchtwegen en het maagdarmkanaal, waar ze zich gedragen als een eerste verdedigingslinie tegen externe beledigingen3-6. MC's worden vaak subgeklasseerd op basis van hun "baseline" fenotypische kenmerken en hun anatomische locaties. Bij muizen zijn twee soorten MC's beschreven: "bindweefsel-type" MC's (CTMCs) en mucosale MC's (MMC's)1-3,7,8. CTMCs bevinden zich vaak rond venules en in de buurt van zenuwvezels en bevinden zich in serosale holtes, terwijl MMC's intra-epitheliale locaties in de darm en het ademhalingsslijmvlies1-3bezetten.
Talrijke methoden zijn toegepast om biologische functies van MC 's9-13te bestuderen . Veel groepen hebben zich gericht op in vitro benaderingen met behulp van cellijnen (zoals de menselijke MC-lijnen HMC114 of LAD215,16),in vitro afgeleide MC's (zoals menselijke perifere bloedafname MC's17, of muis beenmerg-afgeleide gekweekte MC's [BMCMCs]18, foetale huid-afgeleide gekweekte MC's [FSCMC's]19 en peritoneale cel-afgeleide MC's [PCMC's] Al deze modellen worden veel gebruikt om moleculaire details van MC-biologie te bestuderen, zoals signaleringsroutes die betrokken zijn bij MC-activering. Een belangrijk aspect van de MCs-biologie is echter dat hun fenotypische en functionele kenmerken (bijv.cytoplasmatisch granulaat proteasegehalte of reactie op verschillende stimuli) kunnen worden gemoduleerd door anatomische locatie en micromilieu2,7. Aangezien de exacte mix van dergelijke factoren die in vivo worden aangetroffen moeilijk in vitrokan worden gereproduceerd , geven wij de voorkeur aan het gebruik van in vivo benaderingen om inzicht te krijgen in MC-functies9.
Er bestaan verschillende muizenstammen met genetisch MC-deficiëntie, zoals de veel gebruikte WBB6F1-Kit W/W-v of C57BL/6-Kit W-sh/W-sh muizen. Deze muizen missen expressie en/of activiteit van KIT (CD117), de receptor voor de belangrijkste MC groeifactor stamcelfactor (SCF)21,22. Als gevolg hiervan hebben deze muizen een ernstig MC-tekort, maar hebben ze ook extra fenotypische afwijkingen die verband houden met hunc-kitmutaties (in de WBB6F1-Kit W/W-v muizen) of met de effecten van de grote chromosomale inversie die resulteert in verminderde c-kit expressie (in de C57BL/6-Kit W-sh/W-sh muizen)9,10,12,23. Meer recentelijk zijn verschillende muizenstammen metc-kit-onafhankelijke constitutieve MC-deficiëntie gemeld24-26. Al deze muizen en enkele extra nieuwe soorten inductieve MC-deficiënte muizen zijn onlangs in detail beoordeeld9,10,13.
Hier beschrijven we methoden voor het genereren van van beenmerg afgeleide gekweekte MC's (BMCMCs), hun adoptieve overdracht in MC-deficiënte muizen en de analyse van de aantallen en distributie van adoptief overgedragen MC's op verschillende anatomische locaties. Deze zogenaamde "mast cell knock-in"-methode kan worden gebruikt om de functies van MC's en MC-afgeleide producten in vivote beoordelen . We bespreken de voordelen en beperkingen van deze methode, in het licht van alternatieve benaderingen die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Mastcellen (MC's) zijn hematopoëtische cellen die zich in verschillende weefsels bevinden en vooral overvloedig aanwezig zijn op plaatsen die zijn blootgesteld aan de externe omgeving, zoals huid, luchtwegen en maagdarmkanaal. Vooral bekend om hun schadelijke rol in IgE-afhankelijke allergische reacties, zijn MC's ook naar voren gekomen als belangrijke spelers in gastheerverdediging tegen gif en binnendringende bacteriën en parasieten. MC-fenotype en -functie kunnen worden beïnvloed door micromilieufactoren die kunnen verschillen afhankelijk van de anatomische locatie en/of op basis van het type of stadium van ontwikkeling van immuunresponsen. Om deze reden hebben wij en anderen de voorkeur gegeven aan in vivo benaderingen boven in vitro methoden om inzicht te krijgen in MC-functies. Hier beschrijven we methoden voor het genereren van van beenmerg afgeleide gekweekte MC's (BMCMCs), hun adoptieve overdracht in genetisch MC-deficiënte muizen en de analyse van de aantallen en distributie van adoptief overgedragen MC's op verschillende anatomische locaties. Deze methode, genaamd de'mast cell knock-in'-benadering, is de afgelopen 30 jaar veel gebruikt om de functies van MC's en MC-afgeleide producten in vivote beoordelen . We bespreken de voordelen en beperkingen van deze methode, in het licht van alternatieve benaderingen die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld.

Een overzicht van de 'mastcel knock-in' benadering is weergegeven in figuur 1, en omvat de generatie van BMCMCs, het aantal cellen dat i.p., i.d. of i.v. moet worden gegrafeerd in MC-deficiënte muizen (het aantal kan worden gevarieerd indien aangegeven op basis van het experimentele ontwerp) en het interval tussen engraftment en experiment afhankelijk van de injectieplaats (dit interval kan ook variëren, indien aangegeven; b.v., neemt het gehalte aan opgeslagen mediatoren in MC cytopl...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

We beschrijven een methode voor het genereren van in vitro afgeleide mestcellen, hun engraftment in mastceldeficiënte muizen, en de analyse van het fenotype, aantallen en distributie van geïgrafeerde mestcellen op verschillende anatomische locaties. Dit protocol kan worden gebruikt om de functies van mestcellen in vivote beoordelen .

Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Een Microplate Assay aan chemische Effecten op RBL-2H3 mestceldegranulatie Assess: Effecten van Triclosan, zonder gebruik van een organisch oplosmiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Generatie van Knock-out primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Adoptieve immunotherapie van iNKT-cellen in glucose-6-fosfaat-isomerase (G6PI)-Geïnduceerde RA-muizen

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...