Name: analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

N.G. הוא מקבל מלגות מן הצרפתית "פונדציה לשפוך la Recherche Médicale FRM" וקרן פיליפ; R.S. נתמך על ידי קרן לוסיל פקארד לבריאות הילדים ופרס סטנפורד NIH / NCRR CTSA מספר UL1 RR025744; נ.ב. נתמך על ידי מלגת מקס קייד של קרן מקס קייד והאקדמיה האוסטרית למדעים ומלגת שרודינגר של קרן המדע האוסטרית (FWF): J3399-B21; S.J.G. מכיר בתמיכה של המכונים הלאומיים לבריאות מעניק U19 AI104209, NS 080062 ומהתוכנית לחקר מחלות הקשורות לטבק באוניברסיטת קליפורניה; L.L.R. מכיר בתמיכה של קרן המחקר הלאומית דלקת פרקים (ANRF) ומכוני הבריאות הלאומיים מענק K99AI110645.

כל הטיפול והניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ובאישור ספציפי של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת סטנפורד.
1. יצירה ואפיון של תאי פיטום תרבותיים (BMCMCs) שמקורם במח העצם.
הערה: BMCMCs התורם צריך להיווצר מתאי מח עצם מאו...

כמעט 30 שנה לאחר תיאורו הראשוני38, הגישה 'תא התורן לדפוק ב' ממשיכה לספק מידע רב ערך על מה MCs יכול לעשות או לא יכול לעשות vivo. הפונקציות של MCs נחשבו זמן רב להיות מוגבל לתפקידם באלרגיה. נתונים שנוצרו באמצעות גישת 'תא התורן knock-in' שינו השקפה זו, על ידי מתן ראיות כי MCs יכול, בין היתר, ...

תאי פיטום (MCs) הם תאים hematopoietic הנובעים אבות מח עצם פלוריפוטנטי1-3. בעקבות יציאה מח עצם, MCs אבות נודדים לתוך רקמות שונות שבו הם מתפתחים לתוך MCs בוגרת תחת השפעת גורמי גדילה מקומיים1-3. MCs תושבי רקמות ממוקמים אסטרטגית בממשקי סביבה מארחת, כגון העור, דרכי הנשימה ומערכת העיכול, שם הם מתנהגים כקו הגנה ראשון מפני עלבונות חיצוניים3-6. MCs מסווגים לעתים קרובות על סמך המאפיינים הפנוטיפיים "הבסיסיים" שלהם והמיקומים האנטומיים שלהם. בעכברים תוארו שני סוגים של MCs: MCs מסוג "רקמת חיבור" (CTMCs) ומחשבי MCs הרירית (MMCs)1-3,7,8. CTMCs ממוקמים לעתים קרובות סביב venules ליד סיבי עצב, ומתגוררים בחללים serosal, בעוד MMCs לכבוש מיקומים תוך-אפיתל במעיים רירית הנשימה1-3.
מתודולוגיות רבות יושמו כדי ללמוד פונקציות ביולוגיות של MCs9-13. קבוצות רבות התמקדו בגישות במבחנה באמצעות קווי תאים (כגון הקווים האנושיים MC HMC114 או LAD215,16), IN VITRO נגזר MCs (כגון MCs נגזר דם היקפי אנושי17, או עצם העכבר נגזר תרבית MCs [BMCMCs]18, MCs בתרבית עור עוברי [FSCMCs]19 ומחשבים גרפיים [PCMCs]20) או MCs מבודדים ex vivo מאתרים אנטומיים שונים. כל המודלים האלה נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד פרטים מולקולריים של ביולוגיה MC, כגון איתות מסלולים המעורבים בהפעלת MC. עם זאת, היבט חשוב של הביולוגיה MCs הוא כי המאפיינים הפנוטיפיים והפונקציונליים שלהם (למשל,תוכן פרוטאז גרנול ציטופלסמי או תגובה לגירויים שונים) ניתן לווסת על ידי מיקום אנטומי microenvironment2,7. מאז התערובת המדויקת של גורמים כאלה כי הם נתקלים vivo עשוי להיות קשה לשחזר במבחנה, אנו מעדיפים להשתמש בגישות vivo כדי לקבל תובנות פונקציות MCs9.
קיימים מספר זנים של עכברים עם מחסור גנטי ב- MC, כגון עכברי WBB6F1-קיט W/W-v או C57BL/6-קיט W-sh/W-sh. עכברים אלה חסרים ביטוי ו/או פעילות של KIT (CD117), הקולטן של גורם הגדילה העיקרי של MC גורם תאי גזע (SCF)21,22. כתוצאה מכך, לעכברים אלה יש מחסור עמוק ב- MC אך יש להם גם חריגות פנוטיפיות נוספות הקשורות למוטציותערכת c שלהם (ב- WBB6F1-קיט W / W-v עכברים) או להשפעות של היפוך כרומוזומלי גדול שתוצאתוביטוי ערכת c מופחתת (ב C57BL / 6 -קיט W-sh / W-sh עכברים)9,10,12,23. לאחרונה, מספר זנים של עכברים עם c-קיט- מחסור עצמאי MC מכונן דווחו24-26. כל העכברים האלה וכמה סוגים חדשים נוספים של עכברים חסרי השכלה MC נבדקו לאחרונה בפירוט9,10,13.
כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת MCs מתורבתים שמקורם בעצם העכבר (BMCMCs), העברתם המאמצת לעכברים חסרי MC וניתוח המספרים וההתפלגות של MCs שהועברו באופן מאמץ באתרים אנטומיים שונים. שיטה זו שנקראת 'תא התורן לדפוק ב' ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציות של MCs ומוצרים שמקורם MC ב vivo. אנו דנים ביתרונות ובמגבלות של שיטה זו, לאור גישות חלופיות שפותחו בשנים האחרונות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

תאי פיטום (MCs) הם תאים hematopoietic אשר שוכנים ברקמות שונות, והם שופעים במיוחד באתרים חשופים לסביבה החיצונית, כגון עור, דרכי הנשימה ומערכת העיכול. ידוע בעיקר בשל תפקידם המזיק בתגובות אלרגיות תלויות IgE, MCs הופיעו גם כשחקנים חשובים בהגנה המארחת מפני ארס ופלש חיידקים ולטפילים. פנוטיפ MC ותפקוד יכול להיות מושפע גורמים microenvironmental שעשויים להיות שונים בהתאם למיקום האנטומי ו / או מבוסס על סוג או שלב ההתפתחות של תגובות חיסוניות. מסיבה זו, אנחנו ואחרים העדפנו בגישות vivo על פני שיטות במבחנה כדי לקבל תובנה פונקציות MC. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת MCs מתורבתים של מח עצם העכבר (BMCMCs), העברתם המאמצת לעכברים לקויי MC גנטית, וניתוח המספרים וההתפלגות של MCs שהועברו באופן מאמץ באתרים אנטומיים שונים. שיטה זו, בשם'תא התורן knock-in' גישה, נעשה שימוש נרחב במהלך 30 השנים האחרונות כדי להעריך את הפונקציות של MCs ומוצרים שמקורם MC ב vivo. אנו דנים ביתרונות ובמגבלות של שיטה זו, לאור גישות חלופיות שפותחו בשנים האחרונות.

סקירה כללית של גישת 'חיקוי תא התורן' מוצגת באיור 1, וכוללת את הדור של BMCMCs, את מספר התאים שיש לחרוט i.p., i.d. או i.v. לעכברים חסרי MC (המספר יכול להיות מגוון אם צוין בהתבסס על העיצוב הניסיוני) ואת המרווח בין חריטה לניסוי בהתאם לאתר ההזרקה (מרווח זה גם יכול להשתנות, אם צוין; למשל, התוכ...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

אנו מתארים שיטה ליצירת תאי פיטום שמקורם במבחנה, חריטה שלהם לעכברים חסרי תאים תורניים, וניתוח של פנוטיפ, מספרים והפצה של תאי פיטום חרוטים באתרים אנטומיים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את הפונקציות של תאי פיטום ב vivo.

ניתוח הפונקציות של תאי פיטום ב Vivo באמצעות 'תא התורן לדפוק ב' עכברים

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

חיסוני המאמצת של תאים iNKT ב גלוקוז-6-פוספט איזומראז (G6PI)-הנגרמת עכברים RA

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

הערכה של תאי עוזר T זקיקים ותגובת מרכז חיידקים במהלך שפעת זיהום וירוס בעכברים

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...