Name: analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

N.G. è il destinatario di borse di studio della "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" francese e della Fondazione Philipp; R.S. è supportato dalla Lucile Packard Foundation for Children's Health e dal numero di premio STANFORD NIH/NCRR CTSA UL1 RR025744; P.S. è sostenuta da una Borsa max Kade della Fondazione Max Kade e dall'Accademia austriaca delle scienze e da una Borsa di studio Schroedinger del Fondo scientifico austriaco (FWF): J3399-B21; S.J.G. riconosce il sostegno dei National Institutes of Health grants U19 AI104209, NS 080062 e del Tobacco-Related Disease Research Program presso l'Università della California; L.L.R. riconosce il sostegno della Arthritis National Research Foundation (ANRF) e della Sovvenzione nazionale per gli istituti sanitari K99AI110645.

Tutta la cura e la sperimentazione degli animali sono state condotte nel rispetto delle linee guida dei National Institutes of Health e con l'approvazione specifica dell'Institutional Animal Care and Use Committee della Stanford University.
1. Generazione e caratterizzazione di mastociti coltivati derivati dal midollo osseo (BBMCMC).
Nota: I BBMCMC donatori devono essere generati da cellule del midollo osseo dello stesso background genetico dei topi riceventi carenti ...

Quasi 30 anni dopo la sua descrizioneiniziale 38,l'approccio'mast cell knock-in'continua a fornire preziose informazioni su ciò che i PC possono fare o non possono fare in vivo. Si pensava che le funzioni dei TC fossero limitate al loro ruolo nell'allergia. I dati generati utilizzando l'approccio "mast cell knock-in" hanno cambiato questa visione, fornendo prove che i MC possono, tra le altre funzioni, svolgere ruoli critici nella difesa dell'ospitecontro alcuni agenti patogeni...

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che derivano da progenitori pluripotenti del midolloosseo 1-3. A seguito dell'egressione del midollo osseo, i progenitori di MC migrano in vari tessuti dove si sviluppano in MC maturi sotto l'influenza di fattori dicrescita locali 1-3. I MC residenti nei tessuti si trovano strategicamente nelle interfacce host-ambiente, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale, dove si comportano come una prima linea di difesa contro gli insultiesterni 3-6. I MC sono spesso sottoclassificato in base alle loro caratteristiche fenotipiche "basale" e alle loro posizioni anatomiche. Nei topi sono stati descritti due tipi di TC: I MAT (CTMC) di tipo tessuto connettivo e i MC mucosi (MMC)1-3,7,8. I CTMC si trovano spesso intorno alle vene e vicino alle fibre nervose e risiedono in cavità sierosali, mentre gli MLC occupano posizioni intraepiteliali nell'intestino e nella mucosarespiratoria 1-3.
Numerose metodologie sono state applicate per studiare le funzioni biologiche dei MC9-13. Molti gruppi si sono concentrati su approcci in vitro utilizzando linee cellulari (come le linee MC umane HMC114 o LAD215,16),MC derivati in vitro (come MC17derivati dal sangue periferici umani o derivati dal midollo osseo del topo MC coltivati [BCMCC]18, MC coltivati derivati dalla pelle fetale [FCMCC]19 e MC peritoneali derivati da cellule [PCPC]20) o MC isolati ex vivo provenienti da diversi siti anatomici. Tutti questi modelli sono ampiamente utilizzati per studiare i dettagli molecolari della biologia MC, come le vie di segnalazione coinvolte nell'attivazione MC. Tuttavia, un aspetto importante della biologia delle CCI è che le loro caratteristiche fenotipiche e funzionali(ad esempio,contenuto di proteasi del granulo citoplasmatico o risposta a diversi stimoli) possono essere modulate dalla posizione anatomica e dal microambiente2,7. Poiché l'esatta miscela di tali fattori che si incontrano in vivo può essere difficile da riprodurre in vitro,favoriamo l'utilizzo di approcci in vivo per ottenere informazioni sulle funzioni9 delle TC.
Esistono diversi ceppi di topi con carenza genetica di MC, come i topi WBB6F1-Kit W/W-v o C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Questi topi mancano di espressione e/o attività di KIT (CD117), il recettore per il principale fattore di crescita MC fattore di crescita fattore di cellule staminali (SCF)21,22. Di conseguenza, questi topi hanno una profonda carenza di MC ma hanno anche anomalie fenotipiche aggiuntive legate alle loro mutazioni delkit c- (nei topi WBB6F1-Kit W/W-v) o agli effetti della grande inversione cromosomica che si traduce in una ridotta espressione delkit c- (nei topi C57BL/6-Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Più recentemente, diversi ceppi di topi con carenza di MC costitutiva indipendente dalkitc- sono stati segnalati24-26. Tutti questi topi e alcuni nuovi tipi aggiuntivi di topi inducibili a disinvolto mc sono stati recentemente esaminati indettaglio 9,10,13.
Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BBMCMC), il loro trasferimento adottivo in topi a disacienti mc e l'analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo cosiddetto metodo "mast cell knock-in" può essere utilizzato per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che risiedono in vari tessuti e sono particolarmente abbondanti in siti esposti all'ambiente esterno, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale. Meglio noti per il loro ruolo dannoso nelle reazioni allergiche dipendenti dall'IgE, i MC sono anche emersi come attori importanti nella difesa dell'ospite contro il veleno e invadendo batteri e parassiti. Il fenotipo e la funzione MC possono essere influenzati da fattori microambientali che possono differire a seconda della posizione anatomica e/o in base al tipo o allo stadio di sviluppo delle risposte immunitarie. Per questo motivo, noi e altri abbiamo favorito approcci in vivo rispetto ai metodi in vitro per ottenere informazioni sulle funzioni MC. Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BCMCC), il loro trasferimento adottivo in topi geneticamente carenti di MC e l'analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo metodo, chiamato approccio"mast cell knock-in", è stato ampiamente utilizzato negli ultimi 30 anni per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

Una panoramica dell'approccio "mast cell knock-in" è mostrata nella Figura 1, e include la generazione di BBMCC, il numero di cellule che dovrebbero essere innestati i.p., i.d. o i.v. in topi mc-carenti (il numero può essere variato se indicato in base al progetto sperimentale) e l'intervallo tra l'innesto e l'esperimento a seconda del sito di iniezione (anche questo intervallo può variare, se indicato; ad esempio, ilcontenuto di mediatori immagazzinati nei granuli citoplasmatici MC ...

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Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Descriviamo un metodo per la generazione di mastociti derivate in vitro, il loro innesto in topi carenti di mastociti, e l'analisi del fenotipo, dei numeri e della distribuzione delle mastociti innestati in diversi siti anatomici. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le funzioni delle mastociti in vivo.

Analisi delle funzioni delle mastociti in vivo usando topi ' Mast Cell Knock-in'

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