Name: analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

N.G. er mottaker av stipendiater fra den franske "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" og Philipp Foundation; R.S. støttes av Lucile Packard Foundation for Children's Health og Stanford NIH/NCRR CTSA-tildelingsnummer UL1 RR025744; P.S. støttes av et Max Kade Fellowship fra Max Kade Foundation og Det østerrikske vitenskapsakademiet og et Schroedinger Fellowship of the Austrian Science Fund (FWF): J3399-B21; S.J.G. anerkjenner støtte fra National Institutes of Health tilskudd U19 AI104209, NS 080062 og fra Tobacco-Related Disease Research Program ved University of California; L.L.R. anerkjenner støtte fra Arthritis National Research Foundation (ANRF) og National Institutes of Health grant K99AI110645.

All dyrepleie og eksperimentering ble utført i samsvar med retningslinjene fra National Institutes of Health og med den spesifikke godkjenningen av Institutional Animal Care and Use Committee ved Stanford University.
1. Generering og karakterisering av benmarg-avledede dyrkede mastceller (BMCMCer).
Merk: Donor BMCMCs bør genereres fra benmargsceller med samme genetiske bakgrunn som mottakeren MC-mangelfulle mus. Mannlig-avledet donor BMCMCs er ikke egnet for engraft...

Nesten 30 år etter den første beskrivelsen38fortsetter"mastcelle knock-in" -tilnærmingen å gi verdifull informasjon om hva MCer kan gjøre eller ikke kan gjøre in vivo. Funksjonene til MCs ble lenge antatt å være begrenset til deres rolle i allergi. Data generert ved hjelp av'mast celle knock-in' tilnærming har endret denne visningen, ved å gi bevis på at MCs kan, blant andre funksjoner, spille kritiske roller i vertsforsvar mot visse patogener4,39 eller giftstof...

Mastceller (MCs) er hematopoietiske celler som oppstår fra pluripotente benmargsforfedre1-3. Etter benmargsegresjon migrerer MCs forfedre inn i ulike vev der de utvikler seg til modne MCs under påvirkning av lokale vekstfaktorer1-3. Vev-bosatte MCs er strategisk plassert på vertsmiljøgrensesnitt, for eksempel huden, luftveiene og mage-tarmkanalen, hvor de oppfører seg som en første forsvarslinje mot eksterne fornærmelser3-6. MCs er ofte sub-klassifisert basert på deres "baseline" fenotypiske egenskaper og deres anatomiske steder. Hos mus er to typer MCer beskrevet: "bindevevstype" MCs (CTMCer) og mucosal MCs (MMCs)1-3,7,8. CTMCer er ofte plassert rundt venules og nær nervefibre, og ligger i serosale hulrom, mens MMCer opptar intraepitheliale steder i tarmen og respiratorisk slimhinne1-3.
Tallrike metoder er brukt for å studere biologiske funksjoner i MCs9-13. Mange grupper har fokusert på in vitro-tilnærminger ved hjelp av enten cellelinjer (for eksempel de menneskelige MC-linjene HMC114 eller LAD215,16), in vitro-avledede MCer (for eksempel human perifere blodavledede MCer17eller musebenmarg - avledet dyrket MCs [BMCMCs]18, fetal hud-avledet kultivert MCs [FSCMCs]19 og peritoneal celle-avledet MCs [PCMCs]20) eller ex vivo isolerte MCs fra ulike anatomiske nettsteder. Alle disse modellene er mye brukt til å studere molekylære detaljer om MC-biologi, for eksempel signalveier involvert i MC-aktivering. Et viktig aspekt ved MCs biologi er imidlertid at deres fenotypiske og funksjonelle egenskaper (f.eks.cytoplasmisk granulatproteaseinnhold eller respons på forskjellige stimuli) kan moduleres ved anatomisk plassering og mikromiljø2,7. Siden den eksakte blandingen av slike faktorer som oppstår in vivo kan være vanskelig å reprodusere in vitro, favoriserer vi å bruke in vivo tilnærminger for å få innsikt i MCs funksjoner9.
Flere musestammer med genetisk MC-mangel eksisterer, for eksempel de mye brukte WBB6F1-Kit W / W-v eller C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh mus. Disse musene mangler uttrykk og/eller aktivitet av KIT (CD117), reseptoren for den viktigste MC-vekstfaktor stamcellefaktoren (SCF)21,22. Som et resultat har disse musene en dyp MC-mangel, men har også ytterligere fenotypiske abnormiteter relatert til deresc-kit mutasjoner (i WBB6F1-Kit W / W-v mus) eller til effekten av den store kromosomale inversjon som resulterer i redusert c-kit uttrykk (i C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh mus) 9,10,12,23. Mer nylig har flere stammer av mus medc-kit-uavhengig konstituerende MC-mangel blitt rapportert24-26. Alle disse musene og noen ekstra nye typer inducible MC-mangelfulle mus har nylig blitt gjennomgått i detalj9,10,13.
Her beskriver vi metoder for generering av musebenmarg-avledede dyrkede MCs (BMCMCs), deres adoptivoverføring til MC-mangelfulle mus, og analysen av antall og distribusjon av adoptivt overførte MCs på forskjellige anatomiske steder. Denne såkalte "mast cell knock-in" -metoden kan brukes til å vurdere funksjonene til MCs og MC-avledede produkter in vivo. Vi diskuterer fordelene og begrensningene ved denne metoden, i lys av alternative tilnærminger som er utviklet de siste årene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Mastceller (MCs) er hematopoietiske celler som ligger i ulike vev, og er spesielt rikelig på steder utsatt for det ytre miljø, som hud, luftveier og mage-tarmkanalen. MCs er best kjent for sin skadelige rolle i IgE-avhengige allergiske reaksjoner, og har også dukket opp som viktige aktører i vertsforsvaret mot gift og invaderende bakterier og parasitter. MC fenotype og funksjon kan påvirkes av mikromiljøetrementale faktorer som kan variere i henhold til anatomisk plassering og/eller basert på type eller stadium av utvikling av immunresponser. Av denne grunn har vi og andre favorisert in vivo-tilnærminger over in vitro-metoder for å få innsikt i MC-funksjoner. Her beskriver vi metoder for generering av musebenmarg-avledede kultiverte MCs (BMCMCs), deres adoptivoverføring til genetisk MC-mangelfulle mus, og analysen av antall og distribusjon av adoptivt overførte MCer på forskjellige anatomiske steder. Denne metoden, kalt'mast cell knock-in' tilnærming, har blitt mye brukt de siste 30 årene for å vurdere funksjonene til MCs og MC-avledede produkter in vivo. Vi diskuterer fordelene og begrensningene ved denne metoden, i lys av alternative tilnærminger som er utviklet de siste årene.

En oversikt over'mastcelle knock-in' tilnærming vises i figur 1, og inkluderer generering av BMCMCer, antall celler som skal være engrafted i.p., dvs. eller i.v. i MC-mangelfulle mus (antallet kan varieres hvis angitt basert på eksperimentell design) og intervallet mellom engraftment og eksperiment avhengig av injeksjonsstedet (dette intervallet kan også variere, hvis angitt; f.eks.øker innholdet av lagrede mediatorer i MC-cytoplasmatiske granulater jevnt med tiden38). <...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Vi beskriver en metode for generering av in vitro-avledede mastceller, deres engraftment i mastcellemangelmus, og analysen av fenotypen, tallene og fordelingen av engraferte mastceller på forskjellige anatomiske steder. Denne protokollen kan brukes til å vurdere funksjonene til mastceller in vivo.

Analysere funksjonene til mastceller In Vivo ved hjelp av 'Mast Cell Knock-in' Mus

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induksjon av transplantat-mot-vert-sykdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell overvåking ved hjelp av en MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En Microplate Assay å vurdere Kjemiske Effekter på RBL-2H3 Mast Cell degranulation: Effekter av Triklosan uten bruk av et organisk løsemiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Gransker Mast Cell sekresjonsgranuler; fra Biosyntese til eksocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdere Netthinne microglial fagocyttfunksjon<em&gt; I Vivo</em&gt; Ved hjelp av en flowcytometrisystemer basert analyse

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolering av Peritoneum-avledet mastceller og deres funksjonell karakteristikk med Ca2 +-imaging og omfatter degranulering analyser

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakteristikk av Thymus avhengig og uavhengig av Thymus immunglobulin Isotype svar i mus med enzym knyttet Immunosorbent analysen

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Generasjon av Knock-out primære og utvidet menneskelige NK celler ved hjelp av Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Adoptivimmunterapi av iNKT-celler i glucose-6-fosfat isomerase (G6PI)-induserte RA-mus

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Evaluering av T Follikulære hjelperceller og germinal senterrespons under influensa A-virusinfeksjon hos mus

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...