Name: analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

N.G. é o beneficiário de bolsas da francesa "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" e da Fundação Philipp; A R.S. é apoiada pela Lucile Packard Foundation for Children's Health e pelo prêmio Stanford NIH/NCRR CTSA, número UL1 RR025744; P.S. é apoiado por uma Bolsa Max Kade da Fundação Max Kade e da Academia Austríaca de Ciências e uma Bolsa Schroedinger do Fundo Austríaco de Ciência (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconhece apoio de institutos nacionais de saúde doem U19 AI104209, NS 080062 e do Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco na Universidade da Califórnia; L.L.R. reconhece o apoio da Fundação Nacional de Pesquisa da Artrite (ANRF) e dos Institutos Nacionais de Saúde doem K99AI110645.

Todos os cuidados e experimentações em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e com a aprovação específica do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Stanford.
1. Geração e Caracterização de Células de Mastros Cultivados Derivados da Medula Óssea (BMCMCs).
Nota: Os BMCMCs doadores devem ser gerados a partir de células de medula óssea do mesmo fundo genético que os camund...

Quase 30 anos após sua descrição inicial38, a abordagem 'mastro célula knock-in' continua a fornecer informações valiosas sobre o que os MCs podem ou não fazer in vivo. As funções dos MCs foram há muito tempo pensadas para se limitar ao seu papel na alergia. Os dados gerados usando a abordagem 'mastro célula knock-in' mudaram essa visão, fornecendo evidências de que os MCs podem, entre outras funções, desempenhar papéis críticos na defesa do hospedeiro contra certos ...

As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que surgem de progenitores pluripotentes da medula óssea1-3. Após a egressão da medula óssea, os progenitores de MCs migram para vários tecidos onde se desenvolvem em MCs maduros sob a influência de fatores de crescimento locais1-3. Os MCs residentes em tecidos estão estrategicamente localizados em interfaces de ambiente hospedeiro, como a pele, as vias aéreas e o trato gastrointestinal, onde se comportam como uma primeira linha de defesa contra insultos externos3-6. Os MCs são frequentemente sub-classificados com base em suas características fenotípicas "base" e suas localizações anatômicas. Em camundongos, dois tipos de MCs foram descritos: MCs (CTMCs) e MUCOSal MCs (MMCs)1-3,7,8. Os CTMCs são frequentemente localizados em torno de venules e fibras nervosas próximas, e residem em cavidades sorosais, enquanto os MMCs ocupam locais intraepiteliol no intestino e mucosa respiratória1-3.
Inúmeras metodologias têm sido aplicadas para estudar funções biológicas dos MCs9-13. Muitos grupos se concentraram em abordagens in vitro usando linhas celulares (como as linhas mc humanas HMC114 ou LAD215,16),MCs derivados in vitro (como MCs17derivados do sangue periféricos humanos ou M cultivados de medula óssea do rato CS [BMCMCs]18, MCs cultivados derivados da pele fetal [FSCMCs]19 e MCs derivados de células peritoneais [PCMCs]20) ou MCs isolados ex vivo de diferentes sítios anatômicos. Todos esses modelos são amplamente utilizados para estudar detalhes moleculares da biologia mc, como sinalizar caminhos envolvidos na ativação do MC. No entanto, um aspecto importante da biologia dos MCs é que suas características fenotípicas e funcionais (por exemplo,conteúdo de granase de grânulo citoplasmônico ou resposta a diferentes estímulos) podem ser moduladas por localização anatômica e microambiente2,7. Uma vez que a mistura exata de tais fatores que são encontrados in vivo pode ser difícil de reproduzir in vitro,favorecemos o uso de abordagens in vivo para obter insights sobre as funções de MCs9.
Existem várias cepas de camundongos com deficiência genética de MC, como os amplamente utilizados WBB6F1-Kit W/W-v ou C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Estes camundongos carecem de expressão e/ou atividade do KIT (CD117), o receptor para o principal fator de crescimento do MC fator de células-tronco (SCF)21,22. Como resultado, esses camundongos têm uma deficiência de MC profunda, mas também têm anormalidades fenotípicas adicionais relacionadas às suas mutações dekit c (nos camundongos WBB6F1-Kit W/W-v) ou aos efeitos da grande inversão cromossômica que resulta em expressão reduzida dokit C (no C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mouses)9,10,12,23. Mais recentemente, várias cepas de camundongos comc-kit-deficiência de MC constitutivo independente foram relatadas24-26. Todos esses camundongos e alguns novos tipos adicionais de camundongos deficientes de MC indutíveis foram recentemente revisados em detalhes9,10,13.
Aqui, descrevemos métodos para a geração de MCs cultivados derivados da medula óssea do camundongo (BMCMCs), sua transferência adotiva para camundongos deficientes em MC, e a análise dos números e distribuição de MCs adotivamente transferidos em diferentes locais anatômicos. Este método chamado "mastro celular knock-in" pode ser usado para avaliar as funções de MCs e produtos derivados de MC in vivo. Discutimos as vantagens e limitações desse método, à luz de abordagens alternativas que vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que residem em vários tecidos, e são especialmente abundantes em locais expostos ao ambiente externo, como pele, vias aéreas e trato gastrointestinal. Mais conhecidos por seu papel prejudicial em reações alérgicas dependentes de IgE, os MCs também surgiram como atores importantes na defesa do hospedeiro contra veneno e bactérias invasoras e parasitas. O fenótipo e a função do MC podem ser influenciados por fatores microambientais que podem diferir de acordo com a localização anatômica e/ou com base no tipo ou estágio de desenvolvimento das respostas imunes. Por essa razão, nós e outros temos favorecido abordagens in vivo sobre métodos in vitro para obter insights sobre funções mc. Aqui, descrevemos métodos para a geração de MCs cultivados derivados da medula óssea do camundongo (BMCMCs), sua transferência adotiva para camundongos geneticamente deficientes em MC, e a análise dos números e distribuição de MCs adotivamente transferidos em diferentes locais anatômicos. Este método, chamado de abordagem de"knock-in" de células de mastro, tem sido amplamente utilizado nos últimos 30 anos para avaliar as funções de MCs e produtos derivados de MC in vivo. Discutimos as vantagens e limitações desse método, à luz de abordagens alternativas que vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos.

Uma visão geral da abordagem 'mastro célula knock-in' é mostrada na Figura 1, e inclui a geração de BMCMCs, o número de células que devem ser engrafadas i.p., i.d. ou i.v. em camundongos deficientes de MC (o número pode ser variado se indicado com base no design experimental) e o intervalo entre engraftment e experimento dependendo do local da injeção (este intervalo também pode variar, se indicado; por exemplo,o conteúdo dos mediadores armazenados em grânulos citoplasmoló...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Descrevemos um método para a geração de células de mastro derivadas in vitro, seu enenxerto em camundongos deficientes de células de mastro, e a análise do fenótipo, números e distribuição de células de mastro engrafadas em diferentes sítios anatômicos. Este protocolo pode ser usado para avaliar as funções das células de mastro in vivo.

Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Imunologia e Infecção

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...