Name: analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

N.G. är mottagare av stipendier från franska "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" och Philipp Foundation; R.S. stöds av Lucile Packard Foundation for Children's Health och Stanford NIH/NCRR CTSA award number UL1 RR025744; P.S. stöds av max Kade-stipendiet från Max Kade-stiftelsen och den österrikiska vetenskapsakademin och ett Schroedinger-stipendium från Österrikiska vetenskapsfonden (FWF): J3399-B21; S.J.G. erkänner stöd från National Institutes of Health-bidrag U19 AI104209, NS 080062 och från Tobacco-Related Disease Research Program vid University of California; L.L.R. erkänner stöd från Arthritis National Research Foundation (ANRF) och National Institutes of Health grant K99AI110645.

All djurvård och alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna från National Institutes of Health och med särskilt godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee vid Stanford University.
1. Generering och karakterisering av benmärgsbaserade odlade mastceller (BMCMCs).
Anm.: Donator BMCMCs bör genereras från benmärgsceller med samma genetiska bakgrund som mottagarens MC-bristfälliga möss. Han-härledda givaren BMCMCs är inte lämpliga fö...

Nästan 30 år efter den förstabeskrivningen 38fortsätter metoden med" mastcellsknackning" att ge värdefull information om vad MCs kan göra eller inte kan göra in vivo. Funktionerna hos MCs ansågs länge vara begränsade till deras roll i allergi. Data som genereras medhjälp av metoden " mastcellsknackning" har ändrat denna uppfattning genom att tillhandahålla bevis för att MCs bland annat kan spela kritiska roller i värdförsvaret mot vissapatogener 4,39 eller<...

Mastceller (MCs) är hematopoetiska celler som uppstår från pluripotenta benmärgsprogenitorer1-3. Efter benmärgsegression migrerar MCs-stamceller till olika vävnader där de utvecklas till mogna MCs under påverkan av lokalatillväxtfaktorer 1-3. Vävnadsboende MCs är strategiskt placerade vid värdmiljögränssnitt, såsom huden, luftvägarna och mag-tarmkanalen, där de beter sig som en första försvarslinje mot yttreförolämpningar 3-6. MCs är ofta sub-classified baserat på deras "baslinje" fenotypiska egenskaper och deras funktionella platser. Hos möss har två typer av MCs beskrivits: MCs av "bindvävstyp" (CTMCs) och MCs (MCosal MCs)1-3,7,8. CTMCs ligger ofta runt venuler och nära nervfibrer, och bor i serosala håligheter, medan MMCs upptar intraepithelial platser i tarmen och andningsslemhinnan1-3.
Många metoder har tillämpats för att studera biologiska funktioner hos MCs9-13. Många grupper har fokuserat på in vitro-metoder med hjälp av antingen cellinjer (t.ex. de mänskliga MC-linjerna HMC114 eller LAD215,16), in vitro-härledda MCs (t.ex. humana perifera blodbaserade MCs17, eller musbenmärgs-härledda MCs odlade MCs [BMCMCs]18,fetala hud-härledda odlade MCs [FSCMCs]19 och peritoneal cell-härledda MCs [PCMCs]20) eller ex vivo isolerade MCs från olika anatomiska platser. Alla dessa modeller används ofta för att studera molekylära detaljer i MC-biologi, såsom signalvägar som är involverade i MC-aktivering. En viktig aspekt av MCs biologi är dock att deras fenotypiska och funktionella egenskaper(t.ex.cytoplasmic granulat proteas innehåll eller svar på olika stimuli) kan moduleras genom anatomisk plats och mikromiljö2,7. Eftersom den exakta blandningen av sådana faktorer som uppstår in vivo kan vara svår att reproducera in vitro, föredrar vi att använda in vivo-metoder för att få insikter i MCs-funktioner9.
Flera musstammar med genetisk MC-brist finns, såsom de allmänt använda WBB6F1-Kit W/ W-v eller C57BL / 6 -Kit W-sh / W-sh möss. Dessa möss saknar uttryck och/eller aktivitet av KIT (CD117), receptorn för den viktigaste MC-tillväxtfaktorn stamcellsfaktor (SCF)21,22. Som ett resultat har dessa möss en djupgående MC-brist men har också ytterligare fenotypiska avvikelser relaterade till deras c-kit mutationer (i WBB6F1-Kit W / W-v möss) eller effekterna av den stora kromosomal inversion som resulterar i minskad c-kit uttryck (i C57BL/6-Kit W-sh/W-sh möss)9,10,12,23. På senare tid har flera stammar av möss med c-kit-oberoende konstituerande MC-brist rapporterats24-26. Alla dessa möss och några ytterligare nya typer av inducerbara MC-bristfälliga möss har nyligen granskats i detalj9,10,13.
Här beskriver vi metoder för generering av mus benmärg-härledda odlade MCs (BMCMCs), deras adoptivöverföring till MC-bristfälliga möss och analysen av antalet och fördelningen av adoptiviskt överförda MCs på olika anatomiska platser. Denna så kallade "mastcellsknackning" -metod kan användas för att bedöma funktionerna hos MCs och MC-härledda produkter in vivo. Vi diskuterar fördelarna och begränsningarna med denna metod, mot bakgrund av alternativa tillvägagångssätt som har utvecklats under de senaste åren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Mastceller (MCs) är hematopoetiska celler som finns i olika vävnader, och är särskilt rikliga på platser som utsätts för den yttre miljön, såsom hud, luftvägar och mag-tarmkanalen. Mest kända för sin skadliga roll i IgE-beroende allergiska reaktioner har MCs också dykt upp som viktiga aktörer i värdförsvar mot gift och invaderande bakterier och parasiter. MC fenotyp och funktion kan påverkas av mikromiljömentala faktorer som kan skilja sig åt beroende på anatomisk plats och/eller baserat på typ eller utvecklingsstadium för immunsvar. Av denna anledning har vi och andra gynnat in vivo-metoder framför in vitro-metoder för att få insikt i MC-funktioner. Här beskriver vi metoder för generering av mus benmärg-härledda odlade MCs (BMCMCs), deras adoptivöverföring till genetiskt MC-bristfälliga möss och analysen av antalet och fördelningen av adoptivt överförda MCs på olika anatomiska platser. Denna metod, som kallas"mastcells-knock-in"-metoden, har använts i stor utsträckning under de senaste 30 åren för att bedöma funktionerna hos MCs och MC-härledda produkter in vivo. Vi diskuterar fördelarna och begränsningarna med denna metod, mot bakgrund av alternativa tillvägagångssätt som har utvecklats under de senaste åren.

En översikt över metoden "mastcellsknackning" visas i figur 1och omfattar generering av BMCMC, antalet celler som bör ingraferas i.p., dvs. t.ex.ökar innehållet i lagrade medlare i MC cytoplasmagranulat stadigt med tiden38). Figur 2 visar representativa flöde cytometri analyser och toluidin blå färgning av BMCMCs efter 1, 15 och 45 dagar av kultur i DMEM medium som innehåller i 20% WEHI-3 cell-konditionerade medium som en källa till IL-3. Observera ...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice at JoVE.com

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Vi beskriver en metod för generering av in vitro härledda mastceller, deras engraftment i mast cell-bristfälliga möss och analysen av fenotyp, siffror och fördelning av ingrafted mastceller på olika anatomiska platser. Detta protokoll kan användas för att bedöma funktionerna i mastceller in vivo.

Analysera funktionerna hos mastceller in vivo med hjälp av' mastcell knock-in' möss

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Efter Cell-öde i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Efter infektion av fag lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion av transplantat-mot-värd-sjukdom och<em&gt; In Vivo</em&gt; T cell övervakning med en MHC-matchade musmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En mikroplatta analys för att bedöma Kemiska Effekter på RBL-2H3 mastcelldegranulering: Effekter av Triclosan utan användning av ett organiskt lösningsmedel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Undersöka Mast Cell Sekretorisk Granulat; från Biosyntes till exocytos

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Bedöma Retinal mikrogliaceller fagocytos<em&gt; In Vivo</em&gt; Med hjälp av en flödescytometri-baserad analys

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolering av Peritoneum-derived mastceller och deras funktionella karakterisering med Ca2 +-imaging och degranulering analyser

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering av Thymus-beroende och oberoende av Thymus immunglobulin isotypen Svaren hos möss använder Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Generation av Knock-out primära och utökade mänskliga NK-celler använder Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Adoptiv immunterapi av iNKT-celler i glukos-6-fosfatisomeras (G6PI)-inducerad RA Möss

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Utvärdering av T Follicular Helper Celler och Germinal Center Svar under influensa A Virusinfektion hos möss

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...