Name: use of the teton system to study molecular mechanisms of zebrafish regeneration
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00
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Os autores agradecem Christa Haase, Doris Weber e Brigitte Korte para assistência técnica. Trabalho no laboratório Weidinger é suportado por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 e pela Deutsche Gesellschaft für Kardiologie através de uma Oskar-Lapp-Stipendium e Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

1. Geração de transgênicos TetActivator Peixe Lines <ol><li> Geração de TetActivator construto <ol><li> Clone sequências reguladoras de interesse a montante da cassete de TetActivator no vetor # 1247 utilizando técnicas padrão. Alternativamente, a utilização de técnicas de recombinação para gerar um BAC, em que a cassete TetActivator (vector # 1180) é inserido no primeiro exão do gene alvo, e em que o Tol2 invertido repetições são introduzidos na espinha dorsal de BAC (para um protocolo detalhado rec...

<ol>
	<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Johnson, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines.">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos.">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li><li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li><li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish.">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556 (2011).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin.">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues.">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system.">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li><li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka.">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, (2007).</li></ol>

O peixe-zebra adulto tem uma incrível capacidade de se regenerar com sucesso muitos órgãos internos e apêndices. Um profundo conhecimento dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos requer uma análise específica de tecido de funções dos genes e vias de sinalização. Para isso, o sistema de Teton fornece uma ferramenta eficiente para a expressão do gene espaço-temporalmente controlada em zebrafish embrionárias e adultas. As construções do sistema de Teton ea metodologia descritos neste manuscrito fora...

O peixe-zebra é um bem estabelecido modelo de organismo vertebrado para estudar muitos aspectos do desenvolvimento, a fisiologia, a doença, e regeneração. Com a crescente adopção de peixe-zebra como um modelo para os processos biológicos de pós-embrionárias, ferramentas experimentais para, manipulação específica de tecido da expressão génica indutível ou vias de sinalização tornaram-se cada vez mais importante. Particularmente, os estudos sobre a regeneração de órgãos e apêndice no peixe-zebra adulto têm sofrido com a falta de ferramentas para dissecar os requisitos espaço-temporais de vias de sinalização durante estes processos regenerativos. Actualmente, três sistemas diferentes têm sido usados ​​para alcançar, expressão condicional específica de tecido do gene na regeneração de órgãos de peixe-zebra adulto: o sistema Cre-lox, expressão de mosaico de choque térmico utilizando transgenes indutíveis transposão transgénese mediada por somática, e o sistema de 1 téton -3. Téton refere-se a uma variante de uma tetraciclina-contsistema de activação transcricional laminadas, onde a expressão é activada na presença do antibiótico tetraciclina ou um seu derivado, por exemplo, doxiciclina. O sistema Cre-lox, uma vez que até agora tem sido usado em peixes adultos, depende de uma recombinase Cre controlado-Tamoxifeno (CreERT2), cuja expressão é limitada espacialmente por elementos reguladores específicos de tecido. Remoção Cre-impulsionado de uma cassete de PARAGEM facilita a expressão do gene de interesse accionado por um promotor que deve ser activo em todos os tipos de células 1. Mediada por transposão criação de transgenes somáticas mosaically expressas fornece um sistema para a expressão induzível do transgene em linhagens celulares individuais. A injecção de embriões de peixes-zebra com um transposão Tol2 portador de um gene de interesse sob o controlo transcricional de um promotor de choque térmico resultados em indivíduos quiméricos tipicamente transportam o transgene apenas em linhagens celulares distintas de um órgão de regeneração 2. Embora ambos os sistemas permitem condicional tecido-spea expressão do gene espe-, o sistema Cre-lox não é reversível, e usando a estratégia de rotulagem clonal à base de transposão sofre com a sua natureza estocástica. Assim, nós e outros recentemente adaptado sistemas Teton transgênicos para uso em peixes-zebra, que facilitam temporal e expressão de genes controlados por espacialmente que é sintonizável em adição e reversível 3-5. O sistema utilizado aqui téton compreende um controlador de linha transgénica (TetActivator) em que um de doxiciclina (DOX) -inducible activador transcricional (melhoria transactivador tetraciclina reversa, irtTA, curto TETA) está sob o controle de sequências reguladoras genómicos específicos de tecidos. Em segundo lugar, requer uma linha transgénica respondedor (TetResponder) que abriga um gene de interesse sob o controlo transcricional do operador de tetraciclina (Tet elemento de resposta; tetre) (Figura 1A). Assim, a utilização de combinações específicas de TetActivator e TetResponder linhas permite condicional tecido-específic manipulação da expressão do gene. Temos recentemente utilizou o sistema de Teton para sondar para funções específicas de tecidos de sinalização Wnt / beta-catenina no adulto regeneração da cauda do peixe-zebra fin 3. No protocolo descrito aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para set-up e uso do sistema de Teton no peixe-zebra, em particular para estudos de regeneração fin. Isso inclui instruções detalhadas sobre como gerar TetActivator e TetResponder linhagens transgênicas estáveis ​​e um protocolo de indução transgene em embriões de peixe-zebra e adulto. Além disso, descreve-se técnicas para a verificação da expressão do gene específica para um tecido regenerado em barbatana, incluindo um protocolo para a preparação de criocortes de aletas de peixe-zebra adultos. Além disso, nós discutimos considerações para a concepção do transgene TetActivator, a escolha de um método de transgénese, e detecção da expressão TetResponder. Assim, o objetivo geral deste protocolo é para servir como um modelopara o estabelecimento de um sistema de téton funcional em peixes-zebra para conseguir a expressão do gene específica para um tecido condicional, o qual pode ser aplicado a qualquer tecido de interesse. Nós criamos um vetor TetActivator permitindo I-SCEI ou geração Tol2 mediada de linhas TetActivator estáveis ​​utilizando sequências de regulação genômicas curtas (fragmentos potenciador; banco de dados plasmídeo laboratório Weidinger nenhum 1247;. Figura 1B). Esta construção contém uma cassete que consiste TetActivator da variante mutante M2 do domínio inversa repressor Tet fundido com o vírus Herpes simplex VP16-domínio de transactivação derivado 3F [irtTAM2 (3F)]. Expressão do TetActivator (TETA) pode ser facilmente monitorizada uma vez que é co-expressa com a AmCyan fluoróforo a partir do mesmo enquadramento de leitura aberto; um péptido P2A medeia salto ribossomal, o qual deve resultar na produção de TETA e AmCyan como proteínas separadas a uma razão 1: 1 5,6. O construto também contém um poylinker 5 &#39;do tetActivator cassete para facilitar a inserção de sequências genómicas reguladoras de interesse utilizando métodos de clonagem convencionais. Além disso, criámos um constructo consistindo do acima descrito cassete TetActivator além de uma cassete de selecção com canamicina (base de dados não plasmídeo laboratório Weidinger 1180;. A Figura 1C), o qual pode ser recombinado num cromossoma bacteriano artificial (BAC) contendo uma grande região genómica ( geralmente no codão de iniciação de um gene cuja expressão padrão é para ser mimetizado pelo transgene). Ambas as construções são disponíveis a partir do laboratório Weidinger mediante pedido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding boxes</td>
			<td>Aqua Schwarz</td>
			<td>AquaBox 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound fluorescent microscope</td>
			<td>e.g. Leica, Zeiss</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>to image fluorescent tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>e.g. Leica, Zeiss</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>to image fluorescent tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>e.g. Leica, Thermo-Scientific</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use 1/5000 in PBS 
			for visualization of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) 
			for TetResponder induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2&#903; 2 H2O, 0.33 mM MgSO4&#903;7 H2O, 0.2 &#8240; (w/v) methylene blue, pH 6.5 
			for embryo/larvae husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 
			for fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphat-buffer saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x PBS with 0.1 % Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>1014356190</td>
			<td>for collection of tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope</td>
			<td>e.g. Leica, Zeiss</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>for fluorescence-based genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>e.g. Biorad, Applied Biosystems</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>for PCR-based genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium (TFM)</td>
			<td>Triangel Biomedical Sciences</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td>for embedding of tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>for anesthesia 
			use at 1 mg/ml in E3 embryo medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the teton system to study molecular mechanisms of zebrafish regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Para estabelecer um sistema téton funcional para a expressão do gene induzível específico de tecido, TetActivator transgénicos e linhas TetResponder precisa de ser gerado (Figura 1A). Isto é conseguido por microinjecção TetActivator (Figura 1B - C) ou TetResponder (Figura 1E) constrói em embriões de peixe-zebra primeiros e integração da linha germinal subsequente. TetActivator construções funcionais podem ser gerados por clonagem de sequê...

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Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

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