Name: comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

نود أن نشكر LHW ستيفتونغ، في تريزين ليختنشتاين، لدعم ماليا أبحاثنا على الاكسدة.

تمت الموافقة على الدراسات المتعلقة مقايسة المذنب أجريت في جامعة بازل قسم العيون من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية من بازل 1. إعداد الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (كا ++، والمغنيسيوم ++ مجاني) حل عن طريق إضافة PBS (1 L حزمة) و 990 مل من درهم 2 O إلى وسائل الإعلام. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. تخزين في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الناشر: إعداد 1000 مل إضافة 2.5 M كلوريد الصوديوم (146.1 ز)، و 100 ملي EDTA (37.2 غرام) و 10 ملي Trizma قاعدة (1.2 غرام) في DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة الكهربائي (300 ملي هيدروكسيد الصوديوم / 1 ملم EDTA) وذلك بإضافة 30 مل من 10 M هيدروكسيد الصوديوم و 7.5 مل من EDTA 0.2M، QS إلى 1500 مل درهم 2 O وتخلط جيدا. الحجم الكلي يعتمد على قدرة مربع هلام. قبل استخدامها، وقياس الرقم الهيدروجيني للعازلة لضمان درجة حموضة&gt; 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تحييد تحتوي على 0.4 M تريس (المضافة 48.5 جرام إلى ~ 800 مل درهم 2 O، وضبط درجة الحموضة إلى 7.5)، تتركز (&amp; #62؛ 10 M حمض الهيدروكلوريك) في 1000 مل مع DH 2 O. تخزين الحل في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل تلطيخ. لإيثيديوم بروميد (EtBr، 10X المالية، 20 ميكروغرام / مل) إضافة 10 ملغ من EtBr في 50 مل درهم 2 O وتخزينها في RT. ل1X المالية - مزيج 1 مل مع 9 مل درهم 2 O. الحذر! التعامل مع EtBr بحذر كاف كما هو مادة مسرطنة معروفة. </li></ol> 2. عزل الكريات البيضاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينات دم الإنسان (20 مل) مع مكافحة تجلط الدم مثل الهيبارين باستخدام ثقب الوريدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا اللمفية باستخدام فاصل الخلايا التدرج الكثافة مثل Histopaque. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، وتمييع الدم في نسبة 1: 1 مع برنامج تلفزيوني أو RPMI (بدون FBS) وطبقة أكثر من 600 ميكرولتر فاصل الخلايا السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 1800 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح معطف &quot;الشهباء&quot; في 3-5 مل من PBS / RPMI وطرد في 300 x ج لمدة 10 دقيقة لتكوير الخلايا الليمفاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد الخلايا الليمفاوية من فوق الحدود بين PBS (RPMI) وسائل فاصل الخلايا، باستخدام pipettor. إزالة العصابات الكريات البيض من واجهة بين البلازما وطبقات فصل الخلايا السائلة من كل أنبوب وجمع في أنبوب واحد 50 مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب الحجم الإجمالي إلى 50 مل من البرد Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM). غسل تعليق الخلية ثلاث مرات مع DMEM في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الأرقام الإجمالية للخلايا باستخدام Haemocytometer. تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وaliquote في أنابيب microcentrifuge في 10 7 خلية / أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 0،4 مل من الخلايا في البلاستيك 5 مل أنبوب المتاح. إضافة 1.2 مل 1٪ منخفضة التبلور درجات الحرارة الاغاروز عند 40 درجة مئوية. مزيج بسرعة والماصة 1،2 مل من تعليق خلية على سطح مغطى الاغاروز شريحة المغلفة مسبقا. تجنب إنتاج فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للالاغاروز لجل لحوالي 2 دقيقة. أن تكون متسقة مع الوقت ودرجة الحرارة المستخدمة في التبلور، وضمان أن يتم تعيين الاغاروز بالكامل قبل غمر في حل تحلل. بعد تماما الصورةوآخرون، يغرق في الناشر الحل في ~ 4 درجة مئوية. </li></ol> 3. تحلل والكهربائي ملاحظة: الإجراء المبين هو لالكهربائي في ظل ظروف درجة الحموضة&gt; 13 القلوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد لا يقل عن 2 ساعة على ~ 4 درجات مئوية، وإزالة بلطف الشرائح من الحل الناشر. مكان الشرائح جنبا إلى جنب على مربع هلام الأفقي قرب نهاية واحدة، انزلاق لهم أقرب معا ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء خزانات عازلة مع تقدم طازجة درجة الحموضة عازلة&gt; 13 الكهربائي حتى يغطي مستوى السائل تماما الشرائح (تجنب فقاعات على الاغاروز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الشرائح الجلوس في المخزن المؤقت القلوية لمدة 20 دقيقة للسماح للاسترخاء من الحمض النووي والتعبير عن الضرر القلوي عطوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على إمدادات الطاقة إلى 25 فولت (~ 0.75 V / سم) وضبط الحالي إلى 300 مل أمبير من خلال رفع أو خفض مستوى العازلة. Electrophorese الشرائح لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف الطاقة. رفع بلطف الشرائح من المخزن المؤقت وصالحذاء على صينية هجرة. إسقاط معطف الحكمة الشرائح مع تحييد العازلة. السماح للشرائح على الجلوس لمدة 5 دقائق على الأقل. استنزاف الشرائح وكرر مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الشرائح مع 80 ميكرولتر 1X إيثيديوم بروميد (EtBr) ويترك لمدة 5 دقائق ثم تراجع في الماء المقطر البارد لإزالة وصمة عار الزائدة. ثم وضع ساترة على الشريحة وتخزينها على الفور. متجر الشرائح لمدة شهر في RT في الظروف الجافة. ملاحظة: بقع DNA أخرى (على سبيل المثال،-SYBR الأخضر) يمكن أن تستخدم أيضا. الحذر! ارتداء قفازات واقية لأن معظم الأصباغ هي مطفرة. </li></ol> 4. الكمي للفواصل DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور الحمض النووي من التلف، ومراقبة الشريحة DNA EtBr الملون تحت المجهر 40X الفلورسنت موضوعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم الحمض النووي من التلف كميا في الخلايا عن طريق قياس طول الحمض النووي للهجرة ونسبة DNA هاجر (الشكل 1A). تحديد الحمض النووي من التلف (الشكل 1B) من اللحظة Tail- والزيتون الأحمقالإقليم الشمالي. سبق تعاريف للالذيل لحظة والزيتون -Moment 10/08. ملاحظة: في تجربتنا يكفي لعصا من قبل إحدى المعلمات. يتم تصويرها الخلايا عن طريق تعيين أداة آلية التي تفحص أكثر من الخلايا شريحة المجهر والصور الفوتوغرافية. ويمكن أن يتم التحديد الكمي للفواصل DNA من قبل حزم برمجيات تحليل الصور. هناك العديد من حزم البرامج المختلفة التي تصنع حسب الطلب لالتقاط صورة من الخلايا وتحديد الحمض النووي من التلف. نوصي باستخدام حزمة البرامج نفسها في كافة مراحل التجربة. يحدد فني مختبر خلية سليمة أو المذنب أن يسجل على الكمبيوتر وينقر بالماوس على ذلك. ثم سجلت الخلية المذنب أو سليمة تلقائيا. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+fields+and+DNA+damage.">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity.">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li><li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer:+role+of+lipid+peroxidation,+DNA+damage,+and+repair.">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li><li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair:+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration.">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li><li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure.">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li><li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients.">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li><li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes.">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li><li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration.">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li><li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women.">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial.">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li><li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

لا شيء.

كان علماء سويديون أوستلينج وجوهانسون الأولى من نوعها في مجال عملهم لاستخدام مقايسة المذنب لتحديد الحمض النووي من التلف في الخلايا 1. شروط محايدة اثنين من العلماء تستخدم، ولكن فقط يسمح للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. سينغ وآخرون. تكييفها في وقت لاحق مقايسة للاستخدام تحت الظروف القلوية، التي أنتجت نسخة الحساسة التي يمكن تقييم فواصل الحمض النووي المزدوج والمفرد الذين تقطعت بهم السبل وكشف مواقع القلويات عطوب 12. منذ تطوره الأولية، تم تعديل مقايسة على الخطوات المختلفة لجعلها مناسبة لتقييم أنواع من الحمض النووي من التلف في أنواع مختلفة من الخلايا 13-15. كما هو الحال مع جميع التقنيات، مع إيلاء اهتمام دقيق إلى التفاصيل الفنية المهم للحصول على نتائج دقيقة 16. بناء على خبرتنا، ويتم الحصول على أفضل النتائج إذا كل خطوة من إعداد المنهجية حل لالمذنب والكمي التي يقوم بها المختبر ميتاليك الخبراءicians. استخدام وسائل الإعلام الجديدة واستعداد بشكل صحيح، وتقنيات pipetting لالكافية، والتوقيت الدقيق و(كما ذكر سابقا في قسم النتائج) استخدام الطازجة الكريات البيض ضرورية من أجل تحلل وهلام الكهربائي للحصول على نتائج دقيقة 17. كل الخطوات الفردية في هذا الاختبار هي نفس القدر من الأهمية للحصول على نتائج موثوقة. 16 وفي أفضل النتائج العامة ويتم الحصول على إذا يتم تنفيذ كل خطوة منهجية واحدة من إعداد حل حتى الكمي المذنب خبير technicians.Important مختبر ويبدو أن استخدام وسائل الإعلام الجديدة ومستعدة بشكل صحيح والتقنيات pipetting لكافية، التوقيت الدقيق وكما سبقت الإشارة إليه في القسم نتائج استخدام الكريات البيض الطازج للتحلل وهلام الكهربائي للحصول على نتائج كافية من فحص 17. كما يفعل منهجيات أخرى، وتقنية الفحص المذنب لديها يمضي بهاتاغس وعيوب. كونها طريقة حساسة، وفحص عرضة لعوامل (على سبيل المثال، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية) والتي يمكن أن تزيد فواصل DNA وبالتالي تؤثر على النتائج. أي العوامل التي قد تعزز الاكسدة، باستثناء تلك التي يجري بحثها، ينبغي تجنبها. يمكن الضغوطات زيادة مستوى الإجهاد التأكسدي ليس فقط في الكريات البيض ولكن أيضا في جميع وسائل الدم وغيرها من الخلايا الليمفاوية. كما ذكر في وقت سابق أن هناك العديد من الطرق المختلفة وأكثر مباشرة لقياس الإجهاد التأكسدي 18،19. مقايسة المذنب هو واحد من العديد من الطرق التي لديها بعض المزايا. وتشمل هذه تكلفته النسبية منخفضة، وعدد قليل من الخلايا المطلوبة (&lt;10000 الخلايا) وبالتالي عينات صغيرة من الدم المطلوبة لكل مريض، وخلال فترة قصيرة نسبيا من الوقت اللازم لتحديد الحمض النووي من التلف في الخلايا (حوالي 3 أيام)، حساسيته ولها اسعة الانتشار تطبيقها على الحمض النووي من التلف الحمير في مختلف أنواع الخلايا. في الماضي نختار للعمل مع الكريات البيض منذ كان لدينا تجربة مع هذاكان من نوع الخلية وذلك ينطبق على دراسة معينة المخطط لها. ميزة أخرى للمقايسة المذنب هو أنه يمكن استخدامها للكشف عن أنواع ومستويات الحمض النووي من التلف المختلفة، وبالتالي يمكن تطبيقها في مناطق أخرى مختلفة من الدراسات إلى جانب الاكسدة مثل دراسات إصلاح الحمض النووي، والتجارب مكملات أو دراسات السمية الوراثية. يتم الاعتراف الاكسدة الآن كما لعب دورا حاسما في التسبب في أمراض متعددة. طريقة الفحص المذنب، في حين أن أحد طرق عديدة لقياس الإجهاد التأكسدي 18،19، هو بسيط نسبيا، وتنوعا وغير مكلفة. عندما يتقن، وهذه الطريقة يمكن استخدامها في جميع مجالات الطب التي الاكسدة يلعب دورا 8-10،20،21.

وقد وضعت مقايسة المذنب أول مرة من قبل علماء سويديون أوستلينج وجوهانسون 1. الحمض النووي هو جزيء سالبة الشحنة. خلال الكهربائي، أصغر، شظايا الحمض النووي التالف السفر أسرع نحو القطب الموجب موجبة الشحنة +2. أصغر شظايا الحمض النووي، وأسرع هجرتها نحو القطب الموجب لتشكيل &quot;المذنب&quot; نموذجي مع &quot;الرأس&quot; تتألف من حالها، DNA التالفة و &quot;ذيل&quot; مؤلفة من شظايا الحمض النووي التالف 3. يمكن اصلاحها الحمض النووي التي تضررت من الآليات المختلفة في الجسم 4، والتي تبقي توليد فواصل DNA متوازنة إلى حد ما 5. إذا، ومع ذلك، فإن التوازن هو في صالح فواصل DNA، يمكن فواصل تتراكم وسوف تسهم في نهاية المطاف إلى تطور المرض. DNA لدينا يعاني حوالي 0.000165 الضرر٪ في وقت معين 6. فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحدة تشير إلى وجود خلل في واحد من اثنين من خيوط الحلزون المزدوج DNAبينما هي سبب فواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل عند تلف كل من خيوط الحلزون المزدوج DNA. هناك العديد من العوامل التي قد تعزز كمية فواصل DNA في وقت معين مثل عمر الخلية، ودخان السجائر، الأدوية المختلفة أو الإجهاد التأكسدي 7-9. إذا وتحفظ كل العوامل التي تؤدي إلى فواصل DNA تعزيز المستمر، ثم القياس الكمي للفواصل DNA عن طريق فحص المذنب هو معلمة جيدة غير المباشرة من الاكسدة. يتم استخدام طريقة الفحص المذنب على نحو متزايد اليوم في الطب بما في ذلك طب العيون. وأحد أسباب ذلك هو أن الاكسدة هو المزيد والمزيد من الاعتراف كآلية إمراضي لمختلف الأمراض 8-11 ومقايسة المذنب هو أسلوب واحد التي الأكسدة الإجهاد يمكن أن يكون كميا بشكل غير مباشر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>(CPW59)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM1370)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(E-8751)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(1077-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(TS1006)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Ranbaxy Rankem</td>
			<td>(S0160)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>BDH-Merck</td>
			<td>(89021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM 845)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Spectrochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials required for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Melting Agarose (NMA)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM273)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(A9414)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol - Qualigens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>(500010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor and Tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

كائنات حقيقية النواة أعلى لا يمكن ان يعيش بدون أكسجين؛ بعد، للمفارقة، الأكسجين يمكن أن تكون ضارة لهم. جزيء الأكسجين كيميائيا خامل نسبيا لأنه يحتوي على اثنين من الإلكترونات المفردة تقع في مختلف المدارات بي * مكافحة الترابط. هذه الالكترونات لهما يدور موازية، وهذا يعني أنها تدور في نفس الاتجاه حول المحاور الخاصة بهم. هذا هو السبب في أن جزيء الأكسجين ليس رد الفعل جدا. قد تحدث تفعيل الأوكسجين من قبل اثنين من آليات مختلفة. إما عن طريق تخفيض عبر إلكترون واحد في (خفض أحادي التكافؤ) مرة، أو عن طريق امتصاص الطاقة كافية لعكس اتجاه دوران واحد من الإلكترونات المفردة. وهذا يؤدي إلى إنتاج الأنواع المؤكسدة رد الفعل (ROS). هناك عدد من الطرق التي يمكن للجسم البشري يلغي ROS في حالته الفسيولوجية. إذا تجاوز إنتاج ROS القدرة إصلاح، والنتائج الاكسدة والأضرار جزيئات مختلفة. هناك العديد من الطرق المختلفة التي الاكسدة يمكن أن يكون ليasured. وتركز هذه المخطوطة على إحدى الطرق اسمه الكهربائي هلام الخلية، والمعروفة أيضا باسم &quot;مقايسة المذنب&quot; الذي يسمح بقياس فواصل DNA. إذا يتم الاحتفاظ جميع العوامل المعروفة يسبب التلف في الحمض النووي، وغيرها من الاكسدة المستمر، وكمية من الحمض النووي من التلف تقاس مقايسة المذنب هو معلمة جيدة من الاكسدة. مبدأ بسيط ويعتمد على حقيقة أن جزيئات DNA وسالبة الشحنة. جزيء DNA سليمة لديه مثل حجم كبير أنه لا تهاجر خلال الكهربائي. فواصل DNA، ولكن، إذا كانت النتيجة الحالية في أجزاء أصغر والتي تتحرك في مجال كهربائي نحو القطب الموجب. شظايا أصغر تهاجر أسرع. كما شظايا وأحجام مختلفة النتيجة النهائية للالكهربي ليست خط واضح بل سلسلة متصلة مع شكل مذنب. النظام يسمح لتقدير حجم الناتج &quot;المذنب&quot; وبالتالي فواصل DNA في الخلية.

على الرغم من أن طريقة الفحص المذنب يجعل النتائج استنساخه، فإنه يمكن أن تتأثر مجموعة متنوعة من العوامل. أحد هذه العوامل هو ما إذا كان أو لم يتم cryopreserved الكريات البيض قبل تحلل وهلام الكهربائي أو ما إذا كان يتم تنفيذ هذه الخطوة على الطازجة الكريات البيض الشكل 2 يدل على أن في المجموعة 2، حيث تم cryopreserved الكريات البيض قبل DNA تحلل والكهربائي للهلام SS- وكانت فواصل أعلى بكثير، مما كانت عليه في المجموعة 1 حيث يتم تحلل وهلام -electrophoresis على الخلايا الطازجة. ويمكن أيضا فحص استخدامها لتقييم بشكل غير مباشر الاكسدة النظامية. ويبين الجدول 1 الإحصاءات الوصفية لTail- حظة وOlive- حظة في المدخنين والأصحاء. يكشف البيانات أن تدخين نصف علبة سجائر يوميا أكثر من الضعف فواصل ssDNA في الكريات البيض المتداولة 9. <img alt="الشكل 1A" src= &quot;/ ملفات / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="الرقم 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> الشكل 1. (A) يصور الاداة المستخدمة خلال تحليل مقايسة المذنب. (B) Δ يصور &quot;المذنب&quot; نموذجي مع رئيس مشرق والذيل (تلف الحمض النووي شظايا أصغر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> وكانت الشكل 2. فواصل ssDNA أعلى بكثير عندما cryopreserved الكريات البيض (المجموعة 2) مما كانت عليه عندما كانت تستخدم طازجة الكريات البيض قبل تحلل وهلام الكهربائي. <imgALT = &quot;الجدول 1&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; كان الجدول 1. المدخنون أكثر من ضعف عدد ssDNA يكسر بالمقارنة مع العمر والجنس يقابل صحي غير المدخنين.

Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

يقيس الفحص المذنب فواصل DNA، الناجم عن عوامل مختلفة. إذا يتم الاحتفاظ جميع العوامل (باستثناء الاكسدة) مما تسبب في أضرار الحمض النووي المستمر، وكمية من الحمض النووي من التلف معلمة جيدة غير المباشرة من الاكسدة. والهدف من هذا البروتوكول هو استخدام مقايسة المذنب لقياس غير مباشر من الإجهاد التأكسدي.

المذنب الفحص كتدبير غير مباشر من الجهازية الاكسدة

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

تطبيق على<em&gt; في المختبر</em&gt; الحمض النووي الفحص حماية لتصور الإجهاد خصائص الوساطة من البروتين DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي<em&gt; في المختبر</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

في المختبر الفحص لقياس فسفاتيديل إيثانولامين ناقلة ميثيل آخر

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية كما حبيبات الإجهاد الثدييات

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...