Name: whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal National Institute of Health concedere 1K22AI097291-01 e dal Centro Nazionale per l&#39;avanzamento delle Scienze di traslazione del National Institutes of Health sotto Premio Numero UL1TR000433. Riconosciamo inoltre Prof. Darrell Irvine al MIT e il Prof. Matthias Stephan Fred Hutchinson Cancer Center per il loro contributo al lavoro iniziale sulle nanoparticelle vaccino e OT-I / Luc topi transgenici.

Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato Università sull&#39;uso e la custodia degli animali (UCUCA) presso l&#39;Università del Michigan ed eseguito secondo le politiche e le linee guida stabilite. 1. Sintesi e caratterizzazione di ICMVs Co-caricato con proteine ​​antigene e adiuvante Molecole <ol><li> Mescolare 1: 1 rapporto molare di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoe...

Il protocollo fornito in questo articolo descrive la sintesi e la caratterizzazione di un nuovo sistema di nanoparticelle a base lipidica, chiamato ICMVs, e fornisce il processo di convalida dell&#39;efficacia delle formulazioni di vaccino a base di nanoparticelle di indurre risposte delle cellule CD8 + T antigene-specifiche. Sintesi ICMV si completa in tutte le condizioni acquosa, che è un importante vantaggio rispetto ad altri sistemi comunemente utilizzati polimerici nanoparticelle (ad esempio, poli (lattid...

Sviluppo di un vaccino tradizionale è principalmente impiegato l&#39;approccio empirico di tentativi ed errori. Tuttavia, con il recente sviluppo di una vasta gamma di biomateriali e scoperta di determinanti molecolari di attivazione immunitaria, è ora possibile progettare razionalmente formulazioni di vaccino con spunti biofisici e biochimici derivati ​​da agenti patogeni 1,2. In particolare, diverse piattaforme di distribuzione di droga di particolato sono stati esaminati come portatori di vaccini in quanto possono essere co-caricati con antigeni subunità e agenti immunostimolanti, proteggere i componenti del vaccino dal degrado, e migliorare la loro co-consegna all&#39;antigene cellule presentanti (APC) residente in linfa nodi (LNS), massimizzando in tal modo la stimolazione immunitaria e l&#39;attivazione 3-5. In questo rapporto, descriviamo la sintesi di un sistema di nanoparticelle &quot;-patogeno imitando&quot;, chiamato interbilayer reticolato vescicole multilamellari (ICMVs), che sono stati precedentemente dimostrato come platfor potente vaccinom per lo scatenamento di robusta linfociti T citotossici (CTL) e le risposte immunitarie umorali in entrambi i compartimenti sistemiche e delle mucose 6-9. In particolare, la vaccinazione con ICMVs ottenuti in sostanzialmente migliorata livelli di IgG sieriche contro un antigene della malaria, in confronto con la vaccinazione con adiuvanti convenzionali (ad esempio, allume e Montanide) 7 e anche suscitato risposte CTL potenti contro le cellule tumorali e modelli sfida virali nei topi 9. Qui, utilizzando ICMVs come sistema di nanoparticelle modello di vaccino, si descrivono i metodi per la caratterizzazione di vaccini nano-formulazioni, tra cui le dimensioni delle particelle e le misure di potenziale zeta e il monitoraggio del traffico di particelle per LNs drenanti (dLNs) utilizzando confocale dei tessuti cryosectioned 7. Inoltre, vi presentiamo un metodo basato imaging intero animale di analizzare l&#39;espansione delle risposte CTL nei topi dopo il trasferimento adottivo di antigene-specifiche cellule T CD8 +-luciferasi che esprimono 9,10. Infine, describa tetramero colorazione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) per la quantificazione longitudinale risposte delle cellule T endogene nei topi vaccinati con nanoparticelle 6,9. ICMVs sono una formulazione di nanoparticelle a base lipidica sintetizzata da fusione controllata di liposomi multilamellari semplici in strutture, che vengono poi stabilizzati chimicamente mediante gruppi di testa di fosfolipidi maleimmide-funzionalizzati reticolanti all&#39;interno di strati lipidici con ditiolo reticolanti 6. Una volta che sono sintetizzati ICMVs, una piccola frazione di nanoparticelle può essere utilizzata per determinare la dimensione delle particelle e il potenziale zeta (cioè, carica superficiale di particelle) con un sistema di dispersione dinamica della luce (DLS) e un analizzatore di potenziale zeta. DLS misura le variazioni nella diffusione della luce in sospensioni di particelle, permettendo la determinazione del coefficiente di diffusione e la dimensione idrodinamica delle particelle 11. Il raggiungimento di dimensioni coerente delle particelle da lotto a lotto sintesi è fondamentaledal momento che la dimensione delle particelle è uno dei principali fattori che influenzano drenaggio linfatico di particelle di vaccini per dLNs e la successiva captazione cellulare da APC 12,13. Inoltre, il potenziale zeta può essere ottenuto misurando la velocità della particella quando viene applicata una corrente elettrica, che permette di determinare la mobilità elettroforetica di particelle e superficie delle particelle di carica 11. Assicurare coerenti valori di potenziale zeta delle particelle è importante poiché carica superficiale delle particelle determina stabilità colloidale, che ha un impatto diretto sulla dispersione di particelle durante la conservazione e dopo somministrazione in vivo 14,15. Al fine di monitorare la localizzazione delle particelle di dLNs, ICMVs possono essere etichettati con fluorofori desiderati incluse tinture lipofile e antigeni covalente-tag. A seguito di vaccinazione, i topi possono essere sacrificati in vari momenti, dLNs asportato, cryosectioned, e analizzati con microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione di Drai linfaticaning di entrambi i vettori di vaccino nanoparticelle e antigene dLNs. Le sezioni di tessuto possono inoltre essere marcate con fluorescenza etichettati anticorpi e utilizzati per ottenere ulteriori informazioni, come i tipi di cellule associate con l&#39;antigene e formazione di centri germinali come abbiamo mostrato in precedenza 7. Una volta che la sintesi delle particelle è ottimizzata e la tratta ai dLNs è confermato, è importante per convalidare elicitation in vivo espansione CTL. Al fine di analizzare scatenamento di cellule antigene-specifiche T CD8 + in risposta alla vaccinazione delle nanoparticelle, abbiamo utilizzato un modello di antigene ovalbumina (OVA), con OVA 257-264 peptide (SIINFEKL) immunodominante epitopi delle cellule T CD8 +, che permette analisi dettagliate immunologici di risposte delle cellule T antigene-specifiche per iniziale 16,17 lo sviluppo di vaccini. In particolare, per interrogare le dinamiche di espansione e la migrazione delle cellule antigene-specifiche CD8 + T, abbiamo generato undoppio modello di topo transgenico incrociando lucciola luciferasi che esprimono topi transgenici (Luc) con OT-I topi transgenici che possiedono le cellule CD8 + T con recettore delle cellule T (TCR) specifico per SIINFEKL (in associazione con H-2K b). Da questi topi OT-I / Luc, luciferasi che esprimono, le cellule OT-I T CD8 + possono essere isolati e preparati per il trasferimento adottivo in naïve topi C57BL / 6. Una volta seminato, l&#39;immunizzazione con successo nanoparticelle-OVA contenente comporterà l&#39;espansione delle cellule T trasferiti che possono essere monitorati dal monitoraggio del segnale bioluminescenza con un intero sistema di imaging 9,10 animale. Questa tecnica di imaging corpo intero non invasiva è stato usato con altri antigeni virali o tumorali in passato 18-20, processi di espansione delle cellule T nei tessuti linfoidi e diffusione ai tessuti periferici in modo longitudinale rivelare. Complementare all&#39;analisi di adoptively cellule T CD8 + antigene-specifici trasferiti, endogenole risposte delle cellule T a noi dopo la vaccinazione può essere esaminata con il complesso peptide-maggiore di istocompatibilità (MHC) test tetramero 21, in cui un complesso tetramero peptide-MHC, composta da quattro MHC di classe fluoroforo-tagged molecole I caricato con epitopi peptidici, è impiegato di legare TCR ed etichettare le cellule T CD8 + in modo antigene-specifica. Il test tetramero peptide-MHC può essere effettuata sia in studi della necroscopia terminali per identificare le cellule CD8 + T antigene-specifiche in linfoidi e tessuti periferici o in studi longitudinali con le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenuti da sangue di serie pareggi. Dopo la colorazione linfociti con peptide-MHC tetramero, citofluorimetria analisi viene eseguita per analisi dettagliate sul fenotipo di CTL o la quantificazione della loro frequenza tra cellule T CD8 +.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

I passi necessari per la sintesi di ICMVs sono illustrati in Figura 1 6. In breve, un film lipidico contenenti farmaci lipofili o coloranti fluorescenti è idratata in presenza di farmaci idrofili. Cationi divalenti, quali Ca 2+, si aggiungono a guidare fusione dei liposomi anionici in vescicole multilamellari. Ditiolo crosslinker, come DTT, è aggiunto il &quot;fiocco&quot; lipidi maleimmide-funzionalizzati su apposing strati lipidici, e, infine, rimanendo gruppi maleimmide estern...

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Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

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