Name: whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00
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이 연구는 국립 보건 연구소 1K22AI097291-01을 부여하여 지원 대상 수 UL1TR000433에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 번역 상 과학을 전진을위한 국가 센터로했다. 우리는 또한 백신 나노 입자 및 OT-I / 뤽 형질 전환 마우스의 초기 작업에 기여하기위한 프레드 허친슨 암 센터에서 MIT 교수 마티아스 스테판에서 교수 대럴 어바인을 인정합니다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 기존의 정책과 지침에 따라 사용 및 미시간 대학에서 동물 케어 (UCUCA)에 대학위원회의 승인을 수행 하였다. 1. 합성 및 ICMVs의 특성 단백질 항원과 보조제 분자와 공동로드 <ol><li> 믹스 1 : 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (DOPC) 및 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N의 1 몰비 - [4- (p의 -maleimidophenyl) 부 티?...

본 문서에서 제공된 프로토콜 ICMVs 불리는 합성과 새로운 지질 계 나노 입자 시스템의 특성을 설명하고, 항원 특이 적 CD8 + T 세포 반응을 유도하는 나노 입자 기반 백신 제형의 유효성을 검증하는 방법을 제공한다. ICMV 합성은 종종 손실의 결과로 일반적으로 제조하기위한 유기 용매를 필요로하는 다른 일반적으로 사용되는 고분자 나노 입자 시스템 (예를 들면, 폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 ?...

전통적인 백신 개발은 주로 시행 착오의 실험 방법을 이용 하였다. 그러나, 생체 재료 및 면역 활성화의 분자 결정의 발견의 다양한 배열의 최근 발전과 함께, 그것은 합리적으로 병원균 1, 2에서 파생 된 생물 물리학 및 생화학 적 단서와 백신 제제를 설계 할 수있게되었습니다. 특히, 다양한 입자 약물 전달 플랫폼은 림프절에 상주 열화 백신 성분을 보호하고, 제시 세포를 항원 (장갑차)에 그들의 공동 전달을 향상 그들이 소단위 항원과 면역 자극 에이전트와 공동으로로드 될 수있는 백신 캐리어로서 검토되어왔다 노드 (림프절)은, 따라서 면역 자극 및 활성화 3-5을 극대화. 이전에 강력한 백신 플랫폼,로 입증 된이 보고서에서 우리는, &quot;병원균 모방&quot;나노 입자 시스템의 합성을 설명이라고 interbilayer 가교 다중 층 소포 (ICMVs)강력한 세포 독성 T 림프구 (CTL) 및 전신과 점막 조직 구획 6-9 모두에서 체액 성 면역 반응의 도출을위한 M. 특히, ICMVs 접종 실질적으로 종래의 보조제 (예를 들면, 명반과 몬타나 이드) (7)와 함께 백신에 비해, 말라리아 항원에 대해 혈청 IgG의 수준이 향상되고 또한 종양 세포 및 쥐 9 바이러스 챌린지 모델에 대해 강력한 CTL 반응을 유도 달성했다. 여기에, 모델 백신 나노 입자 시스템으로 ICMVs를 사용하여, 우리는 입자 크기와 제타 전위 측정 및 배수 림프절에 입자 인신 매매의 추적 저온 절단 된 조직 (7)의 공 초점 영상을 활용 (dLNs)를 포함한 백신 나노 제형의 특성에 대한 방법을 설명합니다. 또, 루시퍼 라제 발현 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 대체 9,10- 전송 후에 마우스에서 CTL 반응의 팽창을 분석 전체 동물 이미징 기반 방법을 제시한다. 마지막으로, 우리 드나노 입자 6,9 접종 마우스에서 내인성 T 세포 반응의 길이 정량 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 스크라이브 테트라 머 염색. ICMVs는 화학적 가교제 디티 6 지질 층 내에 가교 말레이 미드 기능화 인지질 헤드 그룹에 의해 안정화되는 다중 층 구조로 간단한 제어 리포좀 융합에 의해 합성 지질 나노 입자 기반 제형이다. ICMVs 합성되면, 나노 입자의 작은 분율은 입자의 크기 및 제타 전위 동적 광산란 (DLS) 시스템 및 제타 전위 분석기 (즉, 입자의 표면 전하)를 결정하는데 사용될 수있다. 확산 계수의 결정 입자 (11)의 유체 역학적 크기를 허용 입자 현탁액에 빛의 산란에 DLS는 변화를 측정. 일괄 합성 배치에서 일관된 입자 크기를 달성하는 것은 중요입자 크기 때문에 장갑차 (12, 13)에 의해 dLNs 이후의 세포 흡수에 백신 입자의 림프 배출에 영향을 미치는 주요 요소 중 하나입니다. 또한, 제타 전위는 입자와 입자 표면 전하 (11)의 전기 영동 이동도의 측정을 허용 전류가인가되는 입자 속도를 측정함으로써 얻어 질 수있다. 입자의 표면 전하가 저장 중 및 생체 내 투여 후 14, 15 입자 분산에 직접적인 영향을 콜로이드 안정성을 결정하기 때문에 입자의 일관된 제타 전위 값을 보장하는 것은 중요하다. dLNs에 입자 현지화를 추적하기 위해, ICMVs은 친 유성 염료 및 공유 태그가 항원을 포함하여 원하는 형광으로 표시 할 수 있습니다. 접종 후, 마우스를, 절제 dLNs는, 다양한 시점에서 안락사 저온 절단하고, 공 초점 현미경으로 분석 될 수있다. 이 기술은 림프 드레 이즈의 시각화 할 수 있습니다나노 입자 백신 사업자와 dLNs에 항원 모두 닝. 우리는 이전에 7 도시 한 바와 같이 조직 섹션들은 부가 적 항원과 배 중심의 형성과 관련된 셀 유형과 같은 형광 표지 된 항체 및 더 많은 정보를 획득하기 위해 이용, 물들 일 수있다. 입자 합성이 최적화되고 dLNs에 매매가 확인되면, 생체의 CTL 확대 추출의 유효성을 확인하는 것이 중요하다. 나노 백신에 응답하여 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 추출을 분석하기 위해, 우리는 상세한 면역 학적 분석을 허용 OVA 257-264 펩티드 (SIINFEKL) 면역 CD8 + T 세포 에피토프와, 모델 항원, 난백 알부민 (OVA)을 이용했다 초기 백신 개발 16,17 대한 항원 특이 적 T 세포 반응. 특히, 팽창 및 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 이동의 역학을 심문, 우리가 생성 한T 세포 수용체 (H-2K의 B와 관련) SIINFEKL 특정 (TCR)와 CD8 + T 세포를 가지고 OT-I 유전자 변형 쥐와 유전자 변형 마우스 (배낭)을 루시 페라 제 - 표현 반딧불 건너 이중 형질 전환 마우스 모델. 이러한 OT-I / 루크 생쥐에서 루시퍼 라제 발현, OT-I CD8 + T 세포를 단리 할 수​​ 있고, 나이브 C57BL / 6 마​​우스에 대체 전송 제조. 씨를 뿌린 후에 OVA 함유 나노 입자가 성공적으로 면역화 동물 전체 촬상 시스템 9,10와 생물 발광 신호를 모니터링함으로써 추적 될 수 전사 T 세포의 확장을 초래할 것이다. 이러한 비 침습적 전신 영상 법은 길이 방식으로 말초 조직에 T 세포 림프 조직에서의 보급 확대와 관련된 프로세스를 드러내는 과거 18-20에 다른 바이러스 또는 종양 항원으로 사용되어왔다. 적응 적 전송 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 분석에 상보, endogeno우리 T 세포 반응이 채용되어, 접종 네 형광 표지 된 MHC 클래스 I 분자로 이루어진 펩타이드 MHC 량체 착물, 펩티드 에피토프와 함께로드하는 펩티드 - 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 테트라 분석법 (21)으로 관찰 할 수 남기 항원 - 특이 적으로 TCR 및 레이블 CD8 + T 세포에 결합한다. 펩티드 - MHC 테트라 분석은 림프 및 말초 조직에서 항원 특이 적 CD8 + T 세포를 식별하기위한 단말기 부검 연구에서 또는 일련의 혈액 무로부터 얻은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)를 가진 길이 방향 연구 중 수행 될 수있다. 펩티드와 MHC 테트라 림프구 묻힌 후, 유동 세포 계측법 분석하는 CD8 + T 세포의 빈도 사이의 CTL의 표현형 또는 정량 분석​​에 대한 상세에 대해 수행된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

ICMVs의 합성에 관련된 단계는도 1 내지 6에 도시된다. 간략하게, 모든 친 유성 약물 또는 형광 염료를 함유하는 지질 막이 친수성 약물의 존재 하에서 수화된다. 이러한 칼슘과 같은 가의 양이온은, 다중 층 소포에 음이온 성 리포좀의 융합을 드라이브에 추가됩니다. DTT 등, 지질 층 apposing, 마지막 외부 말레이 미드 그룹을 나머지의 &quot;스테이플&quot;말레이 미드 기능?...

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Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

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예방 접종 후 기니 돼지 모델에서 측정 T 세포 응답에 최적화 된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...