Name: whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination at JoVE.com

Denne studien ble støttet av National Institute of Health gi 1K22AI097291-01 og ved Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences av National Institutes of Health i henhold Award Antall UL1TR000433. Vi erkjenner også Prof. Darrell Irvine ved MIT og professor Matthias Stephan ved Fred Hutchinson Cancer Center for deres bidrag på den innledende arbeidet med vaksinenanopartikler og OT-I / Luc transgene mus.

Alle forsøkene beskrevet i denne protokollen ble vedtatt av Universitetskomiteen for bruk og vedlikehold av dyr (UCUCA) ved University of Michigan og utført i henhold til de etablerte retningslinjer. 1. Syntese og karakterisering av ICMVs Co-lastet med proteinantigen og Adjuvans Molekyler <ol><li> Blandingsforhold 1: 1 molart forhold mellom 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-fosfokolin (DOPC) og 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -mal...

Protokollen i denne artikkelen beskriver syntese og karakterisering av en ny lipid-baserte nanopartikler system, betegnet ICMVs, og gir prosessen med å validere effektiviteten av nanopartikkel-baserte vaksinepreparater for å fremkalle antigen-spesifikke CD8 + T-celleresponser. ICMV syntesen er fullført i alle vandige tilstand, noe som er en stor fordel sammenlignet med andre vanlig anvendte polymere nanopartikkel-systemer (for eksempel, poly (laktid-ko-glykolid) syre partikler), som typisk krever organiske l...

Tradisjonell vaksineutvikling har i hovedsak benyttet empirisk tilnærming med prøving og feiling. Men med den siste utviklingen av et bredt utvalg av biomaterialer og oppdagelsen av molekylære determinanter for aktivering av immunsystemet, er det nå mulig å rasjonelt designe vaksineformuleringer med biofysiske og biokjemiske signaler avledet fra patogener 1,2. Spesielt har ulike partikkel stoffet levering plattformer blitt undersøkt som vaksinebærere som de kan være co-lastet med subenhet antigener og immunstimulerende midler, beskytte vaksinekomponenter fra degradering, og styrke deres co-levering til antigenpresenterende celler (APC) bosatt i lymfe noder (LNS), og dermed maksimere immun stimulering og aktivisering 3-5. I denne rapporten beskriver vi syntesen av en &quot;patogen-ligne&quot; nanopartikler system, betegnet interbilayer-tverrbundne multilamellære vesikler (ICMVs), som tidligere er vist som en potent vaksine plattform;m for utløsning av robust cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og humorale immunresponser hos både systemiske og slimhinne vevsområder 6-9. Spesielt oppnådde vaksinering med ICMVs vesentlig forbedret serum IgG-nivåer mot malaria antigen, sammenlignet med vaksinering med konvensjonelle hjelpestoffer (for eksempel alun og Montanide) 7 og også utløst sterke CTL-responser mot kreftceller og virale smittemodeller i mus 9. Her, ved hjelp ICMVs som modell vaksine nanopartikkel-system, beskriver vi metoder for karakterisering av vaksinenanoformuleringer, inkludert partikkelstørrelse og Zeta potensial målinger og sporing av partikkel trafficking til drenering LNS (dLNs) utnytte confocal avbildning av cryosectioned vev 7. I tillegg presenterer vi en hel-animalsk bildebasert metode for å analysere utvidelse av CTL-responser i mus etter adoptiv overføring av luciferase-uttrykkende antigen-spesifikke CD8 + T-celler 9,10. Til slutt, vi despiss tetramer farging av perifere mononukleære blodceller (PBMC) for langsgående måling av endogent T-celleresponser hos mus vaksinert med nanopartikler 6,9. ICMVs er et lipid-baserte nanopartikkel-formulering syntetisert ved kontrollert fusjon av liposomer inn i enkle multilamellære strukturer, som deretter kjemisk stabilisert ved tverrbinding av maleimid-funksjonalisert fosfolipid hodegruppene i lipidlagene med ditiol tverrbindere 6. Når ICMVs er syntetisert, kan en liten brøkdel av nanopartikler kan brukes til å bestemme partikkelstørrelse og zeta potensial (dvs. overflateladningen av partikler) med en dynamisk lysspredning (DLS) system og et zeta potensial analysator. DLS måler forandringer i lysspredningen i partikkelsuspensjoner, som tillater bestemmelse av diffusjonskoeffisienten og den hydrodynamiske størrelse av partikler 11. Oppnå konsistente partikkelstørrelse fra parti til parti syntese er kritiskSiden partikkelstørrelsen er en av de viktigste faktorene som påvirker lymfatisk drenering av vaksine partikler til dLNs og påfølgende cellulært opptak av APC 12,13. I tillegg kan zeta-potensialet oppnås ved å måle partikkelhastigheten når en elektrisk strøm påtrykkes, som tillater bestemmelse av den elektroforetiske mobilitet av partikler og partikkeloverflateladning 11. Å sikre konsistente zeta-potensialverdier partikler er viktig fordi overflateladningen på partiklene bestemmer kolloidal stabilitet, som har direkte innvirkning på partikkel dispersjon under lagring og etter in vivo administrering 14,15. For å spore partikkel lokalisering til dLNs kan ICMVs merkes med ønskede fluoroforene inkludert lipofile fargestoffer og kovalent-merket antigener. Etter immunisering, kan mus avlives på ulike tidspunkter, dLNs resected, cryosectioned, og analysert med konfokalmikroskopi. Denne teknikken tillater visualisering av lymfatisk Draining av både nanopartikkel vaksinebærere og antigen til dLNs. Vevssnittene kan i tillegg være farget med fluorescensmerkede antistoffer og brukes for å oppnå mer informasjon, slik som typer av celler assosiert med antigenet, og dannelsen av germinale sentre som vi har vist tidligere 7. Når partikkelen syntese er optimalisert og omsetning til de dLNs er bekreftet, er det viktig å validere utløsning av CTL in vivo ekspansjon. For å analysere utløsning av antigen-spesifikke CD8 + T-celler i respons til nanopartikler vaksinering, har vi benyttet en modell antigen, ovalbumin (OVA), med OVA 257-264 peptid (SIINFEKL) immunodominant CD8 + T-celle epitop, som tillater detaljerte immunologiske analyser av antigen-spesifikke T-celle-responser for første vaksineutvikling 16,17. Spesielt å avhøre dynamikken i ekspansjon og migrering av antigen-spesifikke CD8 + T-celler, har vi generert endobbelt-transgen musemodell ved å krysse ildflue luciferase-uttrykkende transgene mus (Luc) med OT-I transgene mus som har CD8 + T-celler med T-cellereseptoren (TCR) spesifikk for SIINFEKL (i forbindelse med H-2K b). Fra disse OT-I / Luc mus, luciferase-uttrykkende, OT-I CD8 + T-celler kan bli isolert og preparert for adoptiv overføring til naive C57BL / 6-mus. Når seeded, vil vellykket immunisering med OVA-holdige nanopartikler resulterer i utvidelse av den utskilte T-celler, som kan spores ved å overvåke Bioluminescens signal med et helt dyr avbildningssystem 9,10. Denne ikke-invasiv helkropps avbildningsteknikk har vært brukt sammen med andre virale eller tumorantigener i det siste 18-20, avslørende prosessene som er involvert i T-celle-ekspansjon i lymfevev og spredning til perifert vev på en langsgående måte. Komplement til analyse av adoptivt overført antigen-spesifikke CD8 + T-celler, endogenooss T-celleresponser etter vaksinering kan undersøkes med peptid-hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) tetramer assay 21, hvor et peptid-MHC-komplekset tetramer, bestående av fire fluorofor-merket MHC-klasse I-molekyler fylt med peptidepitoper, benyttes å binde TCR og etikett CD8 + T-celler i en antigen-spesifikk måte. Den peptid-MHC tetramer assay kan utføres enten i terminal obduksjon studier for å identifisere antigen-spesifikke CD8 + T-celler i lymfoid og perifert vev eller i langsgående studier med perifert blod mononukleære celler (PBMC) ble oppnådd fra serieblodprøver. Etter farging lymfocytter med peptid-MHC-tetramer, strømningscytometri-analyse blir utført for detaljerte analyser på fenotypen av CTL eller kvantifisering av deres frekvens mellom CD8 + T-celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Trinnene som er involvert i syntesen av ICMVs er illustrert i figur 1 til 6. Kort sagt blir en lipid film inneholdende eventuelle lipofile legemidler eller fluoriserende fargestoffer hydrert i nærvær av hydrofile legemidler. Toverdige kationer, slik som Ca2 +, blir tilsatt for å drive sammensmelting av anioniske liposomer inn i multilamellære vesikler. Ditiol tverrbindingsmiddel, så som DTT, tilsettes til &quot;stift&quot; maleimid-funksjonaliserte lipider på innsidene lipid-...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination at JoVE.com

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Hel-dyr Imaging og strømningscytometriske Teknikker for analyse av Antigen-spesifikke CD8 + T celle responser etter Nanopartikkel Vaksinasjon

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Kupffer Cell Isolasjon for Nanopartikkel Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse av gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utvikling av stamcelle-avledet Antigen-spesifikke Regulatoriske T-cellene mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolasjon og Flowcytometriske analyse av endocervikale Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling av T-celle alloreaktiviteten hjelp Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer flekker og kvantitativ analyse for å fastslå plasseringen, overflod og fenotypen av Antigen-spesifikke CD8 T celler i vev

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

I Vivo Analysen for påvisning av Antigen-spesifikke T-celle Cytolytic funksjon med en vaksinasjon modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Optimalisert Interferon-gamma ELISpot analysen mål T celle tiltak i Guinea Gris modellen etter vaksinering

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...