Name: whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения предоставлять 1K22AI097291-01 и Национального центра Продвижение поступательного наук Национальных Институтов Здоровья в премии Количество UL1TR000433. Мы также признаем, профессор Даррелл Ирвайн в Массачусетском технологическом институте и профессор Маттиас Стефана в Фреда Хатчинсона онкологический центр за их вклад в первоначальной работы по наночастиц вакцин и OT-I / Luc трансгенных мышей.

Все эксперименты, описанные в этом протоколе были одобрены Университета Комитета по использованию и уходу за животными (UCUCA) в Университете Мичигана и осуществляется в соответствии с установленными правилами и руководящими принципами. 1. Синтез и характеристика ICMVs Co заг...

Протокол в этой статье описан синтез и характеристику новой липидной основе системы наночастиц, называемый ICMVs, и обеспечивает процесс проверки эффективности вакцинных препаратов на основе наночастиц, чтобы вызвать антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы. Синтез ICMV завершена во ...

Традиционные развития вакцины в основном использовали эмпирический подход опытной и ошибок. Тем не менее, с недавним развитием широкого спектра биоматериалов и открытий молекулярных детерминант иммунной активации, теперь можно рационально спроектировать вакцинных препаратов с биофизических и биохимических сигналов, полученных от патогенов 1,2. В частности, различные частицы платформы доставки лекарств были рассмотрены в качестве носителей вакцинных как они могут быть совместно с грузом субъединиц антигенов и иммуностимулирующих агентов, защищать компоненты вакцины от деградации и повышения их сотрудничество доставку антиген-представляющие клетки (АРС), проживающих в лимфе узлы (LNS), таким образом, максимально иммунную стимуляцию и активацию 3-5. В этом докладе мы описываем синтез &quot;патогенных имитируя&quot; системы наночастиц, называемые interbilayer сшитого многослойные везикулы (ICMVs), которые ранее были продемонстрированы как мощное platfor вакциным для надежных процессе индукции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и гуморального иммунного ответа в обоих системных и слизистых тканей отсеков 6-9. В частности, вакцинация ICMVs достигается существенно повысить уровень IgG в сыворотке против малярийного антигена, по сравнению с вакцинацией с обычными вспомогательными веществами (например, квасцы и Montanide) 7, а также вызвало мощные ответов CTL против опухолевых клеток и вирусных моделей призов у мышей 9. Здесь, используя ICMVs как система наночастиц модель вакцины, мы опишем методы для характеризации нано-вакцин составов, в том числе размера частиц и дзета-потенциал измерений и отслеживания оборота частицы в дренирующих лимфоузлов (dLNs) с использованием конфокальной микроскопии в тканях cryosectioned 7. Кроме того, мы представляем весь животного изображений на основе метода анализа расширение ответов CTL у мышей после усыновителя передачи люциферазы выражения антиген-специфических CD8 + Т-клеток 9,10. Наконец, мы деписец тетрамер окрашивания мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) для продольной количественного эндогенных ответов Т-клеток у мышей, вакцинированных с наночастицами 6,9. ICMVs являются липидов на основе наночастиц препарат синтезированы путем регулируемого синтеза простых липосом в многослойных структурах, которые затем химически стабилизированных сшивающих головных групп фосфолипидов малеимид-функционализированного в липидных слоев с дитиольному сшивающих агентов 6. После ICMVs синтезируются, небольшая часть наночастиц может быть использовано для определения размера частиц и дзета-потенциал (т.е. поверхностный заряд частиц) с (DLS) системы динамического светорассеяния и дзета-потенциал анализатора. DLS измеряет изменения в рассеянии света в суспензии частиц, что позволяет определение коэффициента диффузии и гидродинамического размера частиц 11. Достижение последовательной размер частиц от партии к партии синтеза является критическимс размером частиц является одним из основных факторов, влияющих на лимфатический дренаж частиц вакцины в dLNs и последующего клеточного поглощения БТР 12,13. Кроме того, дзета-потенциал может быть получен путем измерения скорости частиц, когда электрический ток подводится, которая позволяет определять электрофоретической подвижности частиц и поверхности частиц заряда 11. Обеспечение последовательного дзета-потенциал значения частиц является важным, поскольку поверхностный заряд частиц определяет стабильность коллоидного, который имеет непосредственное влияние на дисперсию частиц во время хранения и после введения в естественных условиях 14,15. Для того, чтобы отслеживать локализацию частиц в dLNs, ICMVs могут быть помечены с заданными флуорофорами в том числе липофильных красителей и ковалентно-меченых антигенов. После иммунизации мышей может быть умерщвлены в различные моменты времени, dLNs резекции, cryosectioned и анализировали с конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет визуализировать лимфатической DraIНин обоих перевозчиков и антигена dLNs вакцин наночастиц. Разделы ткани могут быть дополнительно окрашены флуоресцентной меченых антител и используется для получения более подробной информации, такие как типы клеток, связанных с антигеном и формирования зародышевых центров, как мы показали, ранее 7. После синтеза частиц оптимизирован и торговля в dLNs подтвердится, это очень важно для проверки выявление в в естественных условиях расширения CTL. Для того чтобы проанализировать извлечение антиген-специфических CD8 + Т-клеток в ответ на вакцинацию наночастиц, мы использовали модели антиген, овальбумин (OVA), с OVA 257-264 пептида (SIINFEKL) иммунодоминантном CD8 + Т-клеточного эпитопа, который позволяет детально иммунологические анализы антиген-специфических ответов Т-клеток для первоначального 16,17 разработки вакцины. В частности, допрашивать динамику расширения и миграции антиген-специфических CD8 + Т-клеток, мы сформировалидважды трансгенной мышиной модели, пересекая люциферазы светляков-выражения трансгенных мышей (Luc) с OT-I у трансгенных мышей, которые обладают CD8 + Т-клеток с Т-клеточного рецептора (TCR), специфичные для SIINFEKL (в связи с Н-2К б). Из этих мышей ОТ-I / Luc, экспрессирующих люциферазы, ОТ-я CD8 + Т-клетки могут быть выделены и подготовлены для передачи в приемной наивных мышей C57BL / 6. После семенами, успешное иммунизация OVA-наночастиц приведет к расширению переданных Т-клеток, которые можно отслеживать с помощью мониторинга сигнал биолюминесценции с всей системы формирования изображений животных 9,10. Это неинвазивный метод визуализации всего тела был использован с другими вирусными или опухолевых антигенов в прошлом 18-20, выявление процессов, участвующих в разложении Т клеток в лимфоидных тканей и распространения в периферических тканях в продольном образом. В дополнение к анализу адаптивно переданных антиген-специфических CD8 + Т-клеток, endogenoСША T-клеточные ответы после вакцинации могут быть рассмотрены с пептидом главного комплекса гистосовместимости (МНС) тетрамер анализа 21, в котором тетрамер комплекс пептид-МНС, состоящая из четырех флуорофора с метками МНС-молекул класса I, загруженной с пептидных эпитопов, используют чтобы связать TCR и этикеток CD8 + Т клеток в антиген-специфическим образом. Пептид-МНС тетрамер анализ может выполняться либо в терминальных вскрытии исследований для выявления антиген-специфических CD8 + Т-клеток в лимфоидных и периферических тканях или в продольных исследованиях с мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных от последовательный забор крови. После окрашивания лимфоцитов с пептид-МНС тетрамер, проточной цитометрии анализа выполняется для детального анализа на фенотип ЦТЛ или количественной оценки их частоты среди CD8 + Т-клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Этапы в синтезе ICMVs показаны на рисунке 1 6. Вкратце, липидную пленку, содержащую любые липофильные препараты или флуоресцентные красители гидратируют в присутствии гидрофильных лекарств. Двухвалентные катионы, такие как Ca 2+, добавляют привод сплав анионных липосо?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination at JoVE.com

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Купфер Выделение клеток для наночастиц токсичности тестирования

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Выделение и проточной цитометрии анализ глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Выделение и Flow Cytometric Анализ человеческого Endocervical Гамма-Дельта Т-клеток

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Измерение Т-клетки с помощью визуализации аллореактивности проточной цитометрии

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Оптимизированный интерферона гамма ELISpot Assay мера Т-клеток ответов в модели морской свинки после вакцинации

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...