Name: hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins
Uploaded: 2015-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins at JoVE.com

This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

1. Fremstilling af Parasite Cell Cultures, Indsamling af Parasite Pellets <ol><li> Forbered RPMI-1640-HEPES medier ved tilsætning af 10 g RPMI-1640 pulver, 66 mg gentamycin sulfat, 2 g natriumbicarbonat, 5,9 g HEPES-buffer, 50 mg hypoxanthin og 3,8 g dextrose i 1 liter sterilt dH 2 O. Bland bruge tabel magnetomrører, indtil alt pulveret er opløst i 1 liter destilleret vand. Udfør mikro filtrering af medier ved hjælp 0,22 um filter. Opbevar medier i sterile flasker. </li><li> Vask uinficeret (friske) ty...

<ol>
	<li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania.+cell-free+expression+system.">Leishmania. cell-free expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li><li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+construction+of+expressed+proteomes+using+a+Leishmania+tarentolae.+based+cell-free+expression+system.">Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system.</a> PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+A+method+for+high-level+over-expression+of+Plasmodium.+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Birkholtz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+plasmodial+proteins+for+structural+studies+and+functional+annotation.">Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation.</a> Malar. J. 7, 197 (2008).</li><li>Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+P.+falciparum.+infection+with+protein+microarrays.">Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays.</a> Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Robledo, J. A., Vasta, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+from+protozoan+parasites.">Production of recombinant proteins from protozoan parasites.</a> Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).</li><li>Gowda, D. C., Davidson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+the+malaria+parasite.">Protein glycosylation in the malaria parasite.</a> Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).</li><li>Goshima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+factory+for+converting+the+transcriptome+into+an+in+vitro-expressed+proteome.">Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome.</a> Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).</li><li>Hinnebusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).</li><li>Hino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+cell-free+protein+synthesis+based+on+a+crude+cell+extract+from+Escherichia+coli.,+wheat+germ,+and+rabbit+reticulocytes.">Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes.</a> Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).</li><li>Le Roch, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+gene+function+by+expression+profiling+of+the+malaria+parasite+life+cycle.">Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle.</a> Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).</li><li>Makrides, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+achieving+high-level+expression+of+genes+in+Escherichia+coli.">Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.</a> Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).</li><li>Mehlin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+proteins+from+Plasmodium+falciparum.:+results+from+1000+genes.">Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).</li><li>Mikami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+cell-derived+in+vitro+coupled+transcription/translation+system+optimized+for+production+of+recombinant+proteins.">A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.</a> Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+rhoptry:+Enriched+isolated+from+Plasmodium.+merozoites.">Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites.</a> Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+protein+located+in+Maurer&#8217;s+clefts+underneath+knobs+and+protein+localization+in+association+with+Rhop-3+and+SERA+in+the+intracellular+network+of+infected+erythrocytes.">Plasmodium falciparum. protein located in Maurer&#8217;s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes.</a> Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium.+gene+family+encoding+Maurer&#8217;s+cleft+membrane+proteins:+Structural+properties+and+expression+profiling.">A Plasmodium. gene family encoding Maurer&#8217;s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling.</a> Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+yoelii.:+Novel+rhoptry+proteins+identified+within+the+body+of+merozoite+rhoptries+in+rodent+Plasmodium+malaria.">Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria.</a> Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+merozoite+rhoptries,+identification+of+novel+rhoptry+associated+proteins+from+P.+yoelii.,+P.+chabaudi.,+P.+berghei.+and+conserved+interspecies+reactivity+of+organelles+and+proteins+with+P.+falciparum.+rhoptry-specific+antibodies.">Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies.</a> Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+rhoptry+proteins+of+140/130/110kd+(Rhop-H)+are+located+in+an+electron+lucent+compartment+in+the+neck+of+the+rhoptries.">Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries.</a> J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

De vigtige skridt for en vellykket ekspression af proteiner ved hjælp af to-trins in vitro human celle ytringsfriheden systemet og rensning er: 1) vellykket forstærkning og kloning af gener i pT7CFE-Chis plasmidvektor; 2) overførsel af RNA ved 30 ° C; 3) oversættelse af protein ved 30 ° C i nærvær af RNAse-inhibitor; 4) udvikling af affiniteten baseret oprensningsprotokol hjælp harpiks perler overtrukket med Ni og 5) analyse resultaterne på western blot under anvendelse af polyklonale og monoklonale...

I malaria forskning, ekspression af immunogene proteiner under anvendelse prokaryote eller eukaryote cellebaserede systemer fortsat en udfordring. AT rigdom af Plasmodium genom og ukendte indlæg translationelle mekanismer 14,7, bidrage til de vanskeligheder, der er forbundet med at få ordentligt foldede og immunogene proteiner for antistof produktion og vaccine undersøgelser. Prokaryote systemer såsom Escherichia coli er blevet anvendt til rekombinant proteinekspression. Prokaryote systemer er billige, effektive, producerer høje udbytter af rekombinant protein og har flere kloningsvektorer. Vært E. coli-celler er lette at omdanne og celler vokser hurtigt. Men prokaryote systemer har begrænsninger såsom manglende aminosyresubstitution, posttranslationel modifikation, risiko for forurening, heterogene produkter og akkumulering af rekombinante proteiner i inklusionslegemer 24. I enundersøgelse af Mehlin et al. (2006), blev 1000 åbne læserammer (ORF) udtrykkes. Ca. 7% af de udtrykte proteiner var opløselige 14. Uopløseligheden observerede skyldes den forspændte karakter af generne og den høje frekvens af kodoner, der anvendes ideelt set inden Plasmodium AT rige genom 14. En alternativ strategi til at overvinde dette problem er blevet udviklet ved anvendelse af plasmider eller værtsceller indeholdende tRNA&#39;er der genkender sjældne kodoner eller kodoner, der svarer til frekvenserne 3. Selv efter udførelse af disse optimeringer, er meget små portioner af proteiner udtrykt som opløselig, aktiv og immunogen 14. De cellefrie ekspressionssystemer indeholder alle de komponenter, der er nødvendige for transskription og translation, såsom ribosomer, initieringsfaktorer, forlængelse faktorer (oversættelser faktorer), tRNA og aminoacyl-tRNA syntetaser. Både transkriptions- og translationsreaktioner er koblet i ettrinsprocedure 11,29. Den transcriptio n reaktion udføres i et rør før passende mængde mRNA inkuberes med oversættelse maskiner i et andet rør 11,29. Selv om disse fremgangsmåder har succes i Plasmodium sp. Proteinekspression, en væsentlig ulempe er længden af tid for proteinekspression, der er ca. 22 timer 29. Hertil kommer, at høje omkostninger af forsyninger til optagelse i protokollerne 29, de arbejdskraftintensive præparater af cellelysat og uoverensstemmelser i komponent præparater, gør disse systemer uopnåelige. Hovedfokus for forskere for udvikling af en celle ytringsfrihed systemet afhænger af faktorer såsom hurtig genetisk modifikation, hurtige udbytter med høje koncentrationer og ligetil præparater lysat 1. Eukaryote systemer, såsom gær, mammale cellelinier, baculovirus medieret ekspressionssystem, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum og parasitære ekspressionssystemer such som Leishmania er blevet anvendt til rekombinant proteinekspression 7. Eukaryote systemer deler fylogenetiske forhold, og derfor også dele karakteristika såsom glycosylering, acylering, disulfidbindingsdannelse, chaperone interaktion, proteolyse og sub-cellulær opdeling. Proteinsekretion begivenheder i eukaryoter forhindre ansamling og reducerer toksiciteten for ekspressionssystemer 13. Anvendelsen af gær-systemer foretrækkes, da de er egnede til proteinekspression i stor skala og til opnåelse af høje udbytter 4. To P. falciparum-proteiner PfCP-29 og Pvs25 blev fremstillet under anvendelse gærsystemet 4. Imidlertid en stor ulempe ved syntesen af de fleste af proteinerne var uregelmæssige N og O-glycosyleringsmønstre, forkert foldning og trunkering af proteiner fra deres native form 4. Anvendelsen af ​​mammale celler til syntese af rekombinante proteiner er arbejdskrævende, og det er omkostSive at opretholde stabile rekombinante cellelinier 4. Derfor er pattedyrceller været begrænset til analyse af protein-signalering, protein-interaktioner og parasit-værts-interaktioner og også til afprøvning DNA-vacciner 4. The Human DNA og mRNA in vitro proteinekspression cellefrit system beskrevet heri er en HeLa-celle-afledt pattedyr-baseret system, der udtrykker proteiner i 3 timer. Proteiner udtrykt ved hjælp pT7CFE1-Chis ekspressionsvektoren har en C-terminal tag letter identifikation og rensning. Den HeLa baserede system suppleres med translationsinitierings- faktorer og en oversættelse regulator, og derved øge effektiviteten af ​​oversættelsen systemet. Proteiner kan hurtigt oversat, afskærmet, verificeret og forarbejdet til brug i forskellige immunologiske og strukturelle applikationer 15. Eukaryote cellefrie ekspressionssystemer, såsom hvedekim og kaninreticulocyt øjeblikket anvendes til ekspression af varskellige eukaryote proteiner, herunder Plasmodium proteiner 11,29. Desuden E. coli baserede cellefrie systemer er også anvendes til eukaryotisk proteinekspression 11. Tabel 1 opsummerer forskellige cellefrie ekspressionssystemer ved at sammenligne træk ved de systemer samt letheden ved hjælp af systemer til proteinekspression. Den humane cellefrit system i forhold til de andre har evnen til at udføre post- og co-translationelle modifikationer og er billigere. Kodonoptimering er muligt og alle reaktionerne kan udføres i 3 timer. Den HeLa-systemet er et ideelt oversættelsessystem for proteinsyntese i indstillingen laboratorium. En væsentlig fordel ved humane cellefrie ekspressionssystemer end andre cellefrie systemer er tilgængeligheden af ​​adskillige forskellige cellelinjer afledt af forskellige organer og væv. Flere sorter af cellefrie systemer kan udformes afhængigt af cellelinjen. Ekstraktens afledt fra pattedyrceller har højere effektivitet til at syntetisere store proteiner end nogen andre celle fri ekspressionssystemer. Disse celle fri ekspressionssystemer kan også bruges i diagnostiske og protein karakterisering applikationer såsom mikro arrays 30. De populære HeLa-cellelinjer anvendes mest til at udføre ekspression af proteiner 33. Det endoplasmatiske reticulum i HeLa-cellelinjer er underudviklet, hvilket fører til fravær af post-translationel glycosylering modifikationsaktivitet 33. Imidlertid er dette system menes at være fordelagtig for Plasmodium proteinsyntese som Plasmodium mangler også glycosylering efter translation modificering 29. Den HeLa cellefri transkription-translation-protokol er let at udføre, billig og proteiner kan udtrykkes i 90 min, klar til rensning og yderligere efterfølgende anvendelser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

Malaria forårsager betydelig global sygelighed og dødelighed. Ingen rutinemæssig vaccine er i øjeblikket tilgængelig. En af de vigtigste årsager til manglen på en vaccine er udfordringen at identificere egnede vaccinekandidater. Malaria proteiner udtrykkes under anvendelse af prokaryote og eukaryote cellebaserede ekspressionssystemer er dårligt glycosylerede, generelt uopløselige og undergår ukorrekt foldning fører til reduceret immunogenicitet. De hvedekim, kaninreticulocytlysat og Escherichia coli lysat cellefrie ekspressionssystemer øjeblikket anvendes til ekspression af malaria proteiner. Men længden af ​​ekspression tid og forkert glycosylering af proteiner stadig en udfordring. Vi demonstrerer ekspressionen af Plasmodium proteiner in vitro ved hjælp af HeLa baseret celle fri ekspressionssystemer, betegnet &quot;in vitro celle fri ekspressionssystemer menneskelige&quot;. De 2 HeLa baseret cellefrie ekspressionssystemer transskribere mRNA i 75 min og 3 pi transcribed mRNA er tilstrækkeligt til at omsætte proteiner i 90 min. Den 1-trins ekspressionssystem er en transkription og translation koblet ekspressionssystem; transkription og co-translation forekommer i 3 timer. Processen kan også udvides til 6 timer ved at give ekstra energi. I 2-trins ekspressionssystem mRNA først transkriberes og derefter tilsat til oversættelse mix for proteinekspression. Vi beskriver, hvordan man kan udtrykke malaria proteiner; en hydrofob PF3D7_0114100 Maurers kløft - 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, et hydrofilt PF3D7_0925900 protein og et bæltedyr gentagelser indeholder protein PF3D7_1361800, ved hjælp af HeLa baserede celle ytringsfriheden system. Proteinerne udtrykkes i mikro mængder anvender 2-trins og 1-trins expression strategier. En affinitet oprensningsmetode at oprense 25 pi proteiner, der udtrykkes ved hjælp af in vitro humane celle fri ekspressionssystem er også beskrevet. Proteinudbytte bestemmes ved Bradfords assay og det udtrykteog oprensede proteiner kan bekræftes ved western blotting-analyse. Udtrykte rekombinante proteiner kan anvendes til immuniseringer, immunassays og protein-sekventering.

Validering af de udtrykte rekombinante proteiner gennem reaktivitet med specifikke antistoffer er et vigtigt første skridt i at bekræfte korrekt foldning af de udtrykte proteiner. Rekombinante malaria proteiner blev udtrykt ved hjælp af et trin og to skridt i vitro menneskelig celle gratis ekspressionssystemer. De rekombinante proteiner oprenses Ni-chelaterende affinitet metode. Vi derefter brugt antisera mod hele merozoit rhoptries i western blotting af SDS-PAGE separerede rekombinante proteiner. <p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins at JoVE.com

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Ekspression af malaria proteiner i cellebaserede systemer stadig en udfordring. Vi demonstrerer to trin og et skridt IVT (in vitro translation) celle gratis ekspressionssystemer til at udtrykke malaria rekombinante rhoptry proteiner fra HeLa-celler. Vi bruger en Ni-harpiks affinitet baseret rensningssystemet for at oprense rhoptry proteiner.

HeLa Baseret Cell ytringsfrihed Systemer til ekspression af<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Vurdering af GFP Expression og levedygtighed Brug af Tali Billed-Based cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Mindre Kerneekstrakter for Funktionelle analyser af gen-ekspression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration af planter til højt niveau transient ekspression af rekombinante proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protokollerne til gennemførelse af en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Baseret TX-TL Cell-Free Expression System for syntetisk biologi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...