Name: hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins
Uploaded: 2015-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins at JoVE.com

This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

1. Utarbeidelse av parasitt cellekulturer, Innsamling av Parasite Pellets <ol><li> Forbered RPMI-1640-Hepes media ved å tilsette 10 g av RPMI-1640-pulver, 66 mg gentamycin sulfat, 2 g natriumbikarbonat, 5,9 g HEPES-buffer, 50 mg hypoxantin og 3,8 g dekstrose i 1 liter sterilt dH 2 O. Bland bruker tabellen magnetrører til alt pulveret er oppløst i en L destillert vann. Utføre mikro filtrering av medier med 0,22 mikrometer filter. Oppbevar media i sterile flasker. </li><li> Vask uinfiserte (frisk) type A ...

<ol>
	<li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania.+cell-free+expression+system.">Leishmania. cell-free expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li><li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+construction+of+expressed+proteomes+using+a+Leishmania+tarentolae.+based+cell-free+expression+system.">Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system.</a> PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+A+method+for+high-level+over-expression+of+Plasmodium.+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Birkholtz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+plasmodial+proteins+for+structural+studies+and+functional+annotation.">Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation.</a> Malar. J. 7, 197 (2008).</li><li>Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+P.+falciparum.+infection+with+protein+microarrays.">Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays.</a> Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Robledo, J. A., Vasta, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+from+protozoan+parasites.">Production of recombinant proteins from protozoan parasites.</a> Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).</li><li>Gowda, D. C., Davidson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+the+malaria+parasite.">Protein glycosylation in the malaria parasite.</a> Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).</li><li>Goshima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+factory+for+converting+the+transcriptome+into+an+in+vitro-expressed+proteome.">Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome.</a> Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).</li><li>Hinnebusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).</li><li>Hino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+cell-free+protein+synthesis+based+on+a+crude+cell+extract+from+Escherichia+coli.,+wheat+germ,+and+rabbit+reticulocytes.">Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes.</a> Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).</li><li>Le Roch, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+gene+function+by+expression+profiling+of+the+malaria+parasite+life+cycle.">Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle.</a> Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).</li><li>Makrides, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+achieving+high-level+expression+of+genes+in+Escherichia+coli.">Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.</a> Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).</li><li>Mehlin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+proteins+from+Plasmodium+falciparum.:+results+from+1000+genes.">Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).</li><li>Mikami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+cell-derived+in+vitro+coupled+transcription/translation+system+optimized+for+production+of+recombinant+proteins.">A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.</a> Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+rhoptry:+Enriched+isolated+from+Plasmodium.+merozoites.">Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites.</a> Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+protein+located+in+Maurer&#8217;s+clefts+underneath+knobs+and+protein+localization+in+association+with+Rhop-3+and+SERA+in+the+intracellular+network+of+infected+erythrocytes.">Plasmodium falciparum. protein located in Maurer&#8217;s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes.</a> Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium.+gene+family+encoding+Maurer&#8217;s+cleft+membrane+proteins:+Structural+properties+and+expression+profiling.">A Plasmodium. gene family encoding Maurer&#8217;s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling.</a> Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+yoelii.:+Novel+rhoptry+proteins+identified+within+the+body+of+merozoite+rhoptries+in+rodent+Plasmodium+malaria.">Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria.</a> Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+merozoite+rhoptries,+identification+of+novel+rhoptry+associated+proteins+from+P.+yoelii.,+P.+chabaudi.,+P.+berghei.+and+conserved+interspecies+reactivity+of+organelles+and+proteins+with+P.+falciparum.+rhoptry-specific+antibodies.">Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies.</a> Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+rhoptry+proteins+of+140/130/110kd+(Rhop-H)+are+located+in+an+electron+lucent+compartment+in+the+neck+of+the+rhoptries.">Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries.</a> J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

Det viktige trinn for vellykket ekspresjon av proteiner ved anvendelse av to-trinns in vitro human cellefritt ekspresjonssystem og rensing er: 1) vellykket amplifikasjon og kloning av gener i pT7CFE-chis plasmidvektor; 2) transkribere RNA ved 30 o C; 3) translasjon av proteinet ved 30 ° C i nærvær av RNase inhibitor; 4) utvikling av affiniteten baserte renseprotokoll ved bruk av harpikskuler belagt med Ni og 5) analyserer resultatene på western blot ved anvendelse av polyklonale og monoklonale antistoffer...

I malaria forskning, ekspresjon av immunogene proteiner ved anvendelse av prokaryote eller eukaryote cellebaserte systemer er fortsatt en utfordring. AT rikdom av Plasmodium genomet og ukjente posttranslasjonell mekanismer 14,7, bidra til vanskelighetene forbundet med å skaffe riktig brettet og immunogeniske proteiner for antistoffproduksjon og vaksinestudier. Prokaryote systemer, for eksempel Escherichia coli er blitt anvendt for rekombinant proteinekspresjon. Prokaryote systemer er rimelig, effektivt produsere høye utbytter av rekombinante proteiner og har flere Kloningsvektorene. Verts E. coli-celler er lett å omforme og celler vokse raskt. Men prokaryote systemer har begrensninger, for eksempel mangel aminosyresubstitusjon, post-translasjonell modifikasjon, risiko for forurensning, heterogene produkter og akkumulering av rekombinante proteiner i inklusjonslegemer 24 av. I enstudie av Mehlin et al. (2006), ble 1000 åpne leserammer (ORF) uttrykt. Ca 7% av de uttrykte proteiner ble 14 løselige. Uoppløseligheten observerte skyldes forspent arten av genene og den høye frekvensen av kodoner som benyttes ideelt sett av Plasmodium AT-rike genom 14. En alternativ strategi for å overvinne dette problemet har blitt utviklet ved hjelp av plasmider eller vertsceller som inneholder tRNA som gjenkjenner sjeldne kodoner eller kodonene som svarer til tre frekvensene. Selv etter å ha utført disse optimaliseringer, er svært små deler av proteiner uttrykt som løselig, aktiv og immunogent 14. De cellefrie ekspresjonssystemer inneholder alle de komponenter som er nødvendige for transkripsjon og translasjon, slik som ribosomer, initiering faktorer, forlengelse faktorer (oversettelser faktorer), tRNA og aminoacyl-tRNA syntetaser. Både transkripsjons- og translasjonselementer reaksjoner er koplet i ett-trinns prosedyre 11,29. Den transcription Reaksjonen utføres i et rør før passende mengde av mRNA blir inkubert med oversettelse maskineri i et annet rør 11,29. Selv om disse metodene har lykkes i Plasmodium sp. Proteinekspresjon, er en stor ulempe hvor lang tid for proteinekspresjon, som er ca. 22 timer 29. I tillegg er den høye kostnaden av forbruksvarer for inkludering i protokollene 29, er arbeidskrevende forberedelser av cellelysatet og inkonsistens i komponent preparater, gjør disse systemene uoppnåelig. Hovedfokus for forskere for utvikling av en celle ytringsfrihet system er avhengig av faktorer som for eksempel rask genmodifisering, raske avlinger med høye konsentrasjoner og rett frem lysat forberedelser 1. Eukaryote systemer slik som gjær, pattedyrcellelinjer, baculovirus mediert ekspresjonssystem, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum og parasitt ekspresjonssystemer such som Leishmania har blitt brukt for rekombinant protein uttrykk 7. Eukaryote systemer dele fylogenetisk forhold og derfor også dele egenskaper som glykosylering, Acyleringen, disulfidbindingen formasjon, anstand samhandling, proteolyse og sub-cellulære compartmentalization. Proteinsekresjon hendelser i eukaryoter hindre opphopning og reduserer giftighet for ekspresjonssystemer 13. Bruken av gjærsystemer er foretrukket som de er egnet for protein ekspresjon i stor skala, og for å oppnå høye utbytter 4. To P. falciparum proteiner PfCP-29 og Pvs25 ble produsert ved hjelp av gjær system 4. Imidlertid er en stor ulempe i syntesen av de fleste av proteinene var uregelmessige N- og O-glykosyleringsmønstre, uriktig folding og avkutting av proteiner fra deres native form 4. Bruken av pattedyrceller for syntese av rekombinante proteiner er arbeidskrevende og den er kostbarSive å opprettholde stabile rekombinante cellelinjer 4. Derfor har pattedyrceller vært begrenset til analyse av protein signalisering, protein interaksjoner og parasitt-vert interaksjoner og også for testing av DNA-vaksiner 4. The Human DNA og mRNA in vitro protein ekspresjon cellefritt system som her er beskrevet er et HeLa celle-avledet pattedyr-basert system som uttrykker proteiner i 3 timer. Proteiner uttrykt ved hjelp pT7CFE1-Chis Ekspresjonsvektor har en C-terminal tag tilrettelegging identifisering og rensing. Den HeLa baserte systemet er supplert med translasjonsinitiering faktorer og en oversettelse regulator, og dermed øke effektiviteten til translasjonssystem. Proteiner kan raskt oversettes, screenet, verifisert og bearbeides for bruk i ulike immunologiske og strukturelle applikasjoner 15. Eukaryote cellefrie ekspresjonssystemer så som hvetespirer og kanin retikulocytt er for tiden anvendt for ekspresjon av Various eukaryote proteiner inkludert Plasmodium proteiner 11,29. I tillegg E. coli-baserte cellefrie systemer er også anvendes for eukaryot protein ekspresjon 11. Tabell 1 oppsummerer forskjellige cellefritt ekspresjonssystemer ved å sammenligne trekk ved de systemer så vel som den enkle å bruke systemer for proteinekspresjon. Den humane cellefrie system i forhold til de andre, har evnen til å utføre post og co-translasjonelle modifikasjoner, og er mindre kostbart. Kodon optimalisering er mulig, og alle reaksjonene kan utføres i 3 timer. HeLa-systemet er et ideelt system for oversettelse proteinsyntese i laboratoriet omgivelser. En stor fordel med humane celle fri ekspresjonssystemer enn andre cellefrie systemer er tilgjengeligheten av flere forskjellige cellelinjer avledet fra forskjellige organer og vev. Flere varianter av cellefrie systemer kan utformes avhengig av cellelinjen. Ekstraktets avledet fra pattedyrceller har høyere effektivitet for å syntetisere store proteiner enn noen andre celle gratis ekspresjonssystemer. Disse celle ytringsfrihet systemer kan også brukes i diagnostiske og protein karakterisering applikasjoner som mikro arrays 30. Den populære HeLa-cellelinjer som er mest brukt til å utføre ekspresjonen av proteiner 33. Det endoplasmatiske retikulum i HeLa cellelinjer er underutviklet, som fører til fravær av post-translasjonell modifikasjon glykosylering aktivitet 33. Imidlertid er dette systemet antas å være fordelaktig for Plasmodium proteinsyntese som Plasmodium også mangler glykosylering stolpe oversettelses modifisering 29. Den HeLa cellefrie transkripsjons-translation protokoll er enkel å utføre, billig og proteiner kan uttrykkes i 90 min, klar for rensing og videre nedstrøms applikasjoner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

Malaria forårsaker betydelig global sykelighet og dødelighet. Ingen rutine vaksine er tilgjengelig for øyeblikket. En av de viktigste årsakene til mangelen på en vaksine er utfordringen med å finne egnede vaksinekandidater. Malaria proteiner uttrykkes ved hjelp av prokaryote og eukaryote cellebasert ekspresjonssystemer er dårlig glykosylert, generelt uløselig og gjennomgå uriktig folding fører til redusert immunogenisitet. De hvetekim, kanin retikulocyttlysat og Escherichia coli lysat celle ytringsfrihet systemer brukes i dag for uttrykk av malaria proteiner. Men lengden av uttrykket tid og uriktig glykosylering av proteiner forblir fortsatt en utfordring. Vi demonstrerer uttrykk for Plasmodium proteiner in vitro bruker HeLa basert celle gratis ekspresjonssystemer, kalt &quot;in vitro humane celle gratis ekspresjonssystemer&quot;. De to HeLa basert celle gratis ekspresjonssystemer transkribere mRNA i 75 min og 3 pl transcribed mRNA er tilstrekkelig til å oversette proteiner i 90 min. Den en-trinns-ekspresjonssystem er en transkripsjon og translasjon koplet ekspresjonssystem; transkripsjonen og co-oversettelse skjer i 3 timer. Fremgangsmåten kan også utvides i 6 timer ved å tilveiebringe ytterligere energi. I to-trinns-ekspresjonssystem blir transkribert mRNA først og deretter tilsettes til blandingen oversettelsen for proteinekspresjon. Vi beskriver hvordan å uttrykke malaria proteiner; en hydrofob PF3D7_0114100 Maurer er Cleft - to trans (PfMC-2TM) protein, en hydrofil PF3D7_0925900 protein og en armadillo gjentar inneholder protein PF3D7_1361800, ved hjelp av HeLa basert celle ytringsfrihet system. Proteinene uttrykt i mikrovolumene som anvender to-trinns og en-trinns uttrykk strategier. En affinitetsrensing metode for å rense 25 ul av proteiner uttrykt ved hjelp av in vitro human cellefritt ekspresjonssystem er også beskrevet. Protein utbytte bestemmes av Bradford assay og uttrykteog rensede proteiner kan bli bekreftet ved western-blotting-analyse. Uttrykte, rekombinante proteiner kan bli brukt for immuniseringer, immunologiske analyser og proteinsekvensering.

Validering av de uttrykte rekombinante proteiner gjennom reaktivitet med spesifikke antistoffer er et viktig første skritt i å bekrefte riktig folding av de uttrykte proteiner. Rekombinante malaria proteiner ble uttrykt ved hjelp av et skritt og to trinn in vitro human celle ytringsfrihet systemer. De rekombinante proteiner er renset Ni-gelaterende affinitet metoden. Vi brukte antisera mot hele merozoit rhoptries i western blotting av SDS-PAGE separerte rekombinante proteiner. Figu...

Watch this Scientific Journal Video about HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins at JoVE.com

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Uttrykk for malaria proteiner i cellebaserte systemer er fortsatt utfordrende. Vi viser to trinn og ett skritt IVT (in vitro oversettelse) celle gratis ekspresjonssystemer for å uttrykke malaria rekombinante rhoptry proteiner fra HeLa-celler. Vi bruker et Ni-resin affinitet baserte rensesystem for å rense rhoptry proteiner.

HeLa Basert Cell ytringsfrihet Systemer for Expression of<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Vurdering av GFP Expression og Livskraftig Bruke Tali Bilde-Based cytometeret

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskala Nuclear Ekstrakter til Funksjonelle analyser av Gene-uttrykk Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration of Plants for High-level Forbigående Expression of rekombinante proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protokoller for å gjennomføre en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Basert TX-TL Cell-Free Expression System for syntetisk biologi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...