Name: hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins
Uploaded: 2015-06-10T14:00:00
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This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

1. Preparación de parásitos Cultivos Celulares, Colección de Parásito Pellets <ol><li> Preparar medios RPMI-1640 con HEPES mediante la adición de 10 g de polvo de RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sodio, 5,9 g de tampón HEPES, 50 mg hipoxantina y 3,8 g de dextrosa en 1 L dH estéril 2 O. Mezclar utilizando la tabla agitador magnético hasta que todos los que se disuelva el polvo en 1 L de agua destilada. Realizar micro filtración de medios utilizando 0,22 micras filtro...

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	<li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania.+cell-free+expression+system.">Leishmania. cell-free expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li><li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+construction+of+expressed+proteomes+using+a+Leishmania+tarentolae.+based+cell-free+expression+system.">Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system.</a> PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+A+method+for+high-level+over-expression+of+Plasmodium.+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Birkholtz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+plasmodial+proteins+for+structural+studies+and+functional+annotation.">Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation.</a> Malar. J. 7, 197 (2008).</li><li>Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+P.+falciparum.+infection+with+protein+microarrays.">Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays.</a> Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Robledo, J. A., Vasta, G. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+gene+function+by+expression+profiling+of+the+malaria+parasite+life+cycle.">Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle.</a> Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).</li><li>Makrides, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+achieving+high-level+expression+of+genes+in+Escherichia+coli.">Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.</a> Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).</li><li>Mehlin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+proteins+from+Plasmodium+falciparum.:+results+from+1000+genes.">Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).</li><li>Mikami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+cell-derived+in+vitro+coupled+transcription/translation+system+optimized+for+production+of+recombinant+proteins.">A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.</a> Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+rhoptry:+Enriched+isolated+from+Plasmodium.+merozoites.">Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites.</a> Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+protein+located+in+Maurer&#8217;s+clefts+underneath+knobs+and+protein+localization+in+association+with+Rhop-3+and+SERA+in+the+intracellular+network+of+infected+erythrocytes.">Plasmodium falciparum. protein located in Maurer&#8217;s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes.</a> Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium.+gene+family+encoding+Maurer&#8217;s+cleft+membrane+proteins:+Structural+properties+and+expression+profiling.">A Plasmodium. gene family encoding Maurer&#8217;s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling.</a> Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+yoelii.:+Novel+rhoptry+proteins+identified+within+the+body+of+merozoite+rhoptries+in+rodent+Plasmodium+malaria.">Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria.</a> Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+merozoite+rhoptries,+identification+of+novel+rhoptry+associated+proteins+from+P.+yoelii.,+P.+chabaudi.,+P.+berghei.+and+conserved+interspecies+reactivity+of+organelles+and+proteins+with+P.+falciparum.+rhoptry-specific+antibodies.">Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies.</a> Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+rhoptry+proteins+of+140/130/110kd+(Rhop-H)+are+located+in+an+electron+lucent+compartment+in+the+neck+of+the+rhoptries.">Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries.</a> J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

Los pasos importantes para la expresión con éxito de proteínas usando dos etapas en el sistema libre de células humanas in vitro la expresión y purificación son: 1) la amplificación y clonación de genes en pT7CFE-CHIS plásmido vector éxito; 2) la transcripción de ARN a 30 ° C; 3) la traducción de proteína a 30 ° C en presencia de inhibidor de RNasa; 4) el desarrollo del protocolo de purificación de afinidad basada usando perlas de resina recubiertas con Ni y 5) el análisis de resultados en we...

En la investigación de la malaria, la expresión de proteínas inmunogénicas utilizando sistemas basados ​​en células procariotas o eucariotas sigue siendo un reto. La riqueza AT del genoma de Plasmodium y los mecanismos de post traduccionales desconocidos 14,7, contribuyen a las dificultades asociadas a la obtención de proteínas correctamente plegadas y inmunogénicas para los estudios de producción de anticuerpos y vacunas. Sistemas procariotas tales como Escherichia coli se han utilizado para la expresión de proteína recombinante. Sistemas procariotas son de bajo costo, eficaces, producen altos rendimientos de proteína recombinante y tienen múltiples vectores de clonación. Anfitrión E. coli células son fáciles de transformar y células crecen rápidamente. Sin embargo, los sistemas procariotas tienen limitaciones tales como la falta de sustitución de aminoácidos, modificación post-traduccional, riesgo de contaminación, productos heterogéneos y acumulación de proteínas recombinantes dentro de cuerpos de inclusión 24. En unestudio de Mehlin et al (2006)., 1000 marcos de lectura abierta (ORF) se expresaron. Aproximadamente el 7% de las proteínas expresadas eran soluble 14. La insolubilidad observado es debido a la naturaleza sesgada de los genes y la alta frecuencia de los codones que se utilizan idealmente por el Plasmodium rica en AT del genoma 14. Una estrategia alternativa para superar este problema se ha desarrollado mediante el uso de plásmidos o células huésped que contienen tRNAs que reconocen codones o codones que coincidan con las frecuencias 3 raras. Incluso después de realizar estas optimizaciones, porciones muy pequeñas de proteínas se expresan como soluble, activo e inmunogénica 14. Los sistemas de expresión sin células contienen todos los componentes necesarios para la transcripción y la traducción, tales como ribosomas, factores de iniciación, factores de elongación (traducciones factores), tRNA y aminoacil-tRNA sintetasas. Ambas reacciones de transcripción y traducción se acoplan en el procedimiento de un solo paso 11,29. El transcription reacción se realiza en un tubo antes de cantidad apropiada de mRNA se incuba con maquinaria de traducción en un 11,29 tubo diferente. Aunque estos métodos tienen éxito en Plasmodium sp. Expresión de proteínas, un inconveniente importante es la longitud de tiempo para la expresión de la proteína, que es aproximadamente 22 hr 29. Además, el alto costo de los suministros para su inclusión en los protocolos 29, los preparativos de trabajo intensivo del lisado celular e inconsistencias en los preparativos de los componentes, hacen de estos sistemas inalcanzable. El objetivo principal de los investigadores para el desarrollo de un sistema de expresión libre de células depende de factores tales como la modificación genética rápida, los rendimientos rápidos con altas concentraciones y preparaciones de lisado adelante rectas 1. Sistemas eucariotas como las levaduras, las líneas celulares de mamíferos, baculovirus sistema de expresión mediada, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum y sistemas de expresión parasitarias Doch como Leishmania se han utilizado para la expresión de proteína recombinante 7. Sistemas eucariotas comparten relación filogenética y por lo tanto también comparten características como la glicosilación, acilación, la formación de enlaces disulfuro, la interacción chaperona, la proteolisis y la compartimentación subcelular. Eventos secreción de proteínas en eucariotas evitar la acumulación y disminuye la toxicidad para los sistemas de expresión 13. Se prefiere el uso de sistemas de levadura, ya que son adecuados para la expresión de proteínas en gran escala y para la obtención de altos rendimientos 4. Dos P. proteínas falciparum PFCP-29 y Pvs25 se produjeron utilizando el sistema de levadura 4. Sin embargo, un inconveniente importante en la síntesis de la mayoría de las proteínas era patrones irregulares de N y O-glicosilación, plegado y truncamiento de proteínas a partir de su forma nativa 4 inadecuada. El uso de células de mamíferos para la síntesis de proteínas recombinantes es un trabajo intensivo y se Expensive para mantener las líneas celulares recombinantes estables 4. Por lo tanto, las células de mamíferos se han limitado para el análisis de señalización de la proteína, interacciones proteína y las interacciones parásito-huésped y también para el ensayo de vacunas de ADN 4. El ADN humano y vitro sistema libre de células mRNA en la expresión de proteínas se describe en el presente documento es un sistema de base de mamífero derivado de células HeLa que expresa las proteínas en 3 hr. Las proteínas expresadas utilizando vector de expresión pT7CFE1-Chis haber una etiqueta C-terminal de facilitar la identificación y purificación. El sistema basado en HeLa se complementa con factores de iniciación de la traducción y un regulador de la traducción, mejorando así la eficiencia del sistema de traducción. Las proteínas se pueden traducir rápidamente, examinados, verificados y procesados ​​para su uso en diversas aplicaciones inmunológicas y estructurales 15. Los sistemas de expresión libres de células eucariotas tales como germen de trigo y de reticulocitos de conejo se utilizan actualmente para la expresión de varproteínas eucariotas pagarés incluyendo proteínas de Plasmodium 11,29. Además, E. sistemas libres de células basados ​​coli también se emplean para la expresión de la proteína eucariota 11. La Tabla 1 resume los diferentes sistemas de expresión libre de células mediante la comparación de características de los sistemas, así como la facilidad de uso de los sistemas para la expresión de proteínas. El sistema libre de células humana en comparación con los otros tiene la capacidad de realizar modificaciones post y co-traduccional y es menos costoso. La optimización de codones es posible y todas las reacciones se puede realizar en 3 hr. El sistema de HeLa es un sistema de traducción ideal para la síntesis de proteínas en el entorno de laboratorio. Una ventaja importante de los sistemas de expresión libre de células humanas sobre otros sistemas libres de células es la disponibilidad de varias líneas celulares diferentes derivadas de diferentes órganos y tejidos. Varias variedades de sistemas libres de células pueden ser diseñados dependiendo de la línea celular. El extracto des derivados de células de mamíferos tienen una mayor eficiencia para sintetizar proteínas grandes que cualquier otro sistema de expresión libre de células. Estos sistemas de expresión de células libres también se pueden utilizar en aplicaciones de diagnóstico y caracterización de proteínas tales como micro matrices 30. Los populares líneas celulares HeLa son los más ampliamente utilizados para llevar a cabo la expresión de proteínas 33. El retículo endoplasmático en las líneas celulares HeLa es subdesarrollado, que conduce a la ausencia de actividad de modificación de la glicosilación post-traduccional 33. Sin embargo, se cree que este sistema a ser ventajoso para la síntesis de proteínas Plasmodium como Plasmodium también carece de modificación posterior a la traducción de glicosilación 29. El protocolo libre de transcripción-traducción de células HeLa es fácil de realizar, de bajo costo y las proteínas se puede expresar en 90 min, listo para la purificación y otras aplicaciones posteriores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

La malaria causa de morbilidad y mortalidad global significativo. Ninguna vacuna rutinaria está disponible actualmente. Una de las principales razones de la falta de una vacuna es el reto de identificar candidatos vacunales adecuados. Proteínas palúdicas expresan utilizando sistemas de expresión procariotas y eucariotas basados ​​en células están mal glicosilados, generalmente insolubles y se someten plegado inadecuada conduce a una inmunogenicidad reducida. Los sistemas de expresión libres de germen de trigo, lisado de reticulocitos de conejo y Escherichia coli lisado de células se utilizan actualmente para la expresión de las proteínas de la malaria. Sin embargo, la longitud de tiempo expresión y glicosilación inadecuada de proteínas sigue siendo un desafío. Demostramos la expresión de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando sistemas de libre expresión basados ​​en células HeLa, denominados &quot;sistemas de expresión in vitro de células humanas libres&quot;. Los sistemas de la libre expresión basados ​​en células HeLa 2 transcriben mRNA en 75 min y 3 l de transcribed mRNA es suficiente para traducir proteínas en 90 min. El sistema de expresión 1-paso es una transcripción y traducción acoplada sistema de expresión; la transcripción y co-traducción se produce en 3 horas. El proceso también se puede extender durante 6 horas al proporcionar energía adicional. En el sistema de expresión de 2 a paso, el ARNm se transcribe primero y después se añadió a la mezcla de traducción de la expresión de la proteína. Describimos cómo expresar proteínas de la malaria; un hidrófobo Acantilado de PF3D7_0114100 Maurer - 2 proteína transmembrana (PFMC-2 ™), una proteína PF3D7_0925900 hidrófilo y un repeticiones armadillo que contienen proteínas PF3D7_1361800, utilizando el sistema de expresión libre de células HeLa basado. Las proteínas se expresan en micro volúmenes que emplean estrategias de expresión de 2 pasos y 1 pasos. Un método de purificación de afinidad para purificar 25 l de proteínas expresadas mediante el sistema de libre expresión in vitro de células humanas también se describe. Rendimiento de proteína se determina mediante el ensayo de Bradford y la expresóy proteínas purificadas se pueden confirmar por análisis de Western Blot. Proteínas recombinantes expresadas se pueden utilizar para inmunizaciones, inmunoensayos y secuenciación de proteínas.

Validación de las proteínas recombinantes expresadas a través de reactividad con anticuerpos específicos es un primer paso importante para confirmar el correcto plegamiento de las proteínas expresadas. Proteínas recombinantes malaria se expresaron mediante el paso y dos pasos en sistemas de expresión libre de células humanas in vitro. Las proteínas recombinantes son método de afinidad Ni-quelante purificada. A continuación, utiliza antisueros contra rhoptries merozoitos enteros en el Western Blot de SDS-PAGE ...

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HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados ​​en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry.

Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

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