Name: hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins
Uploaded: 2015-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins at JoVE.com

This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

1. Framställning av Parasitcellkulturer, Insamling av Parasite Pellets <ol><li> Förbered RPMI-1640-HEPES media genom att tillsätta 10 g RPMI-1640 pulver, 66 mg gentamycin sulfat, 2 g natriumbikarbonat, 5,9 g HEPES-buffert, 50 mg hypoxantin och 3,8 g dextros i 1 L steril dH 2 O. Blanda med hjälp av tabellen magnetomrörare tills allt pulver har löst i 1 liter destillerat vatten. Utför mikrofiltrering av media som använder 0,22 um filter. Förvara media i sterila flaskor. </li><li> Tvätta oinfekterade...

<ol>
	<li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania.+cell-free+expression+system.">Leishmania. cell-free expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li><li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+construction+of+expressed+proteomes+using+a+Leishmania+tarentolae.+based+cell-free+expression+system.">Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system.</a> PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+A+method+for+high-level+over-expression+of+Plasmodium.+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Birkholtz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+plasmodial+proteins+for+structural+studies+and+functional+annotation.">Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation.</a> Malar. J. 7, 197 (2008).</li><li>Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+P.+falciparum.+infection+with+protein+microarrays.">Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays.</a> Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Robledo, J. A., Vasta, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+from+protozoan+parasites.">Production of recombinant proteins from protozoan parasites.</a> Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).</li><li>Gowda, D. C., Davidson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+the+malaria+parasite.">Protein glycosylation in the malaria parasite.</a> Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).</li><li>Goshima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+factory+for+converting+the+transcriptome+into+an+in+vitro-expressed+proteome.">Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome.</a> Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).</li><li>Hinnebusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).</li><li>Hino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+cell-free+protein+synthesis+based+on+a+crude+cell+extract+from+Escherichia+coli.,+wheat+germ,+and+rabbit+reticulocytes.">Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes.</a> Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).</li><li>Le Roch, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+gene+function+by+expression+profiling+of+the+malaria+parasite+life+cycle.">Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle.</a> Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).</li><li>Makrides, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+achieving+high-level+expression+of+genes+in+Escherichia+coli.">Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.</a> Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).</li><li>Mehlin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+proteins+from+Plasmodium+falciparum.:+results+from+1000+genes.">Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).</li><li>Mikami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+cell-derived+in+vitro+coupled+transcription/translation+system+optimized+for+production+of+recombinant+proteins.">A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.</a> Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+rhoptry:+Enriched+isolated+from+Plasmodium.+merozoites.">Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites.</a> Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+protein+located+in+Maurer&#8217;s+clefts+underneath+knobs+and+protein+localization+in+association+with+Rhop-3+and+SERA+in+the+intracellular+network+of+infected+erythrocytes.">Plasmodium falciparum. protein located in Maurer&#8217;s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes.</a> Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium.+gene+family+encoding+Maurer&#8217;s+cleft+membrane+proteins:+Structural+properties+and+expression+profiling.">A Plasmodium. gene family encoding Maurer&#8217;s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling.</a> Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+yoelii.:+Novel+rhoptry+proteins+identified+within+the+body+of+merozoite+rhoptries+in+rodent+Plasmodium+malaria.">Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria.</a> Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+merozoite+rhoptries,+identification+of+novel+rhoptry+associated+proteins+from+P.+yoelii.,+P.+chabaudi.,+P.+berghei.+and+conserved+interspecies+reactivity+of+organelles+and+proteins+with+P.+falciparum.+rhoptry-specific+antibodies.">Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies.</a> Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+rhoptry+proteins+of+140/130/110kd+(Rhop-H)+are+located+in+an+electron+lucent+compartment+in+the+neck+of+the+rhoptries.">Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries.</a> J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

De viktiga stegen för framgångsrik expression av proteiner med användning av två steg in vitro humant cellfritt expressionssystem och rening är: 1) framgångsrik amplifiering och kloning av gener i pT7CFE-Chis plasmidvektor; 2) transkribera RNA vid 30 ° C; 3) översättning av protein vid 30 ° C i närvaro av RNAs-hämmare; 4) utveckla affinitetsbaserade reningsprotokoll med användning av hartspärlor belagda med Ni och 5) analysera resultat på western blot med hjälp av polyklonala och monoklonala a...

I malariaforskning, förblir uttryck av immunogena proteiner med användning av prokaryota eller eukaryota cellbaserade system en utmaning. AT rikedom av Plasmodium genomet och okända posttranslationella mekanismer 14,7, bidra till svårigheter som är förknippade med att få korrekt vikta och immunogena proteiner för produktion och vaccinantikroppsstudier. Prokaryota system såsom Escherichia coli har använts för rekombinant proteinexpression. Prokaryota system är låg kostnad, effektiv, ger höga utbyten av rekombinant protein och ha flera kloningsvektorer. Värd E. coli-celler är lätta att omvandla och celler växer snabbt. Emellertid prokaryota system har begränsningar såsom brist på aminosyrasubstitution, posttranslationell modifiering, risk för förorening, heterogena produkter och ackumulering av rekombinanta proteiner inom inklusionskroppar 24. I enstudie av Mehlin et al. (2006), var 1000 öppna läsramar (ORF) uttryckt. Ungefär 7% av de uttryckta proteinerna var lösliga 14. Olöslig observerade beror på den förspända naturen av generna och den höga frekvensen av kodoner som används idealt av Plasmodium AT-rik genomet 14. En alternativ strategi för att lösa detta problem har utvecklats med hjälp av plasmider eller värdceller innehållande tRNA som känner igen sällsynta kodoner eller kodoner som motsvarar frekvenserna 3. Även efter att ha utfört dessa optimeringar, är mycket små portioner av proteiner uttryckt som löslig, aktiv och immunogena 14. De cellfria expressionssystem innehåller alla de komponenter som krävs för transkription och translation, såsom ribosomer, initieringsfaktorer, elongeringsfaktorer (översättningar faktorer), tRNA och aminoacyl-tRNA-synte. Både transkriptions- och translationsreaktioner är kopplade i ett-steg 11,29. Den transcription Reaktionen utförs i ett rör innan lämplig mängd av mRNA inkuberas med översättningsmaskiner i ett annat rör 11,29. Även om dessa metoder är framgångsrika i Plasmodium sp. Proteinuttryck, är en stor nackdel tidslängden för proteinuttryck, vilket är omkring 22 h 29. Dessutom de höga kostnaderna för leveranser som skall ingå i protokollen 29, arbetsintensiva beredningar av cellysatet och inkonsekvenser i beredningar komponent göra dessa system ouppnåelig. Tyngdpunkten för forskare för utveckling av ett cellfritt expressionssystem beror på faktorer såsom snabb genetisk modifiering, snabba utbyten med höga koncentrationer och rakt framåt lysat preparat 1. Eukaryota system såsom jäst, däggdjurscellinjer, baculovirus medierad expressionssystem, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum och parasituttryckssystem sulm såsom Leishmania har använts för rekombinant proteinuttryck 7. Eukaryota system delar fylogenetiska relation och därmed också dela egenskaper såsom glykosylering, acylering, disulfidbindning bildning, chaperone interaktion, proteolys och sub-cellulär uppdelning. Proteinutsöndring händelser i eukaryoter förhindra ackumulering och minskar toxicitet för expressionssystem 13. Användningen av jästsystem föredras eftersom de är lämpliga för proteinuttryck i stor skala och för att erhålla höga utbyten 4. Två P. falciparum-proteiner PfCP-29 och Pvs25 producerades med användning av jästsystemet 4. Men en stor nackdel i syntesen av de flesta av proteinerna var oregelbundna N och O-glykosyleringsmönster, felaktig vikning och trunkering av proteiner från deras nativa form 4. Användningen av däggdjursceller för syntes av rekombinanta proteiner är arbetsintensivt och det är Expentande att bibehålla stabila rekombinanta cellinjer 4. Därför har däggdjursceller varit begränsade för analys av proteinsignalering, proteininteraktioner och parasit-värd interaktioner och även för att testa DNA-vacciner 4. Human DNA och mRNA in vitro proteinuttryck cellfritt system som beskrivs häri är en HeLa-cellhärledda däggdjursbaserat system som uttrycker proteiner i 3 timmar. Proteiner uttryckta med hjälp av pT7CFE1-Chis uttrycksvektor har en C-terminal tag lätta identifiering och rening. HeLa baserat system kompletteras med translationsinitierings- faktorer och en översättning regulator och därigenom förbättra effektiviteten i översättningssystemet. Proteiner kan snabbt översättas, skärmad verifierade och bearbetas för användning i olika immunologiska och strukturella applikationer 15. Eukaryota cellfria expressionssystem såsom vetegroddar och kaninretikulocyt används för närvarande för uttryck av various eukaryota proteiner inklusive Plasmodium proteiner 11,29. Dessutom, E. coli baserade cellfria system används också för eukaryot proteinuttryck 11. Tabell 1 sammanfattar olika cellfria expressionssystem genom att jämföra egenskaperna hos de system samt hur lätt att använda systemen för proteinuttryck. Den humana cellfritt system i jämförelse med de andra har förmågan att utföra post och co-translationella modifieringar och är billigare. Kodon optimering är möjlig och alla reaktionerna kan utföras i tre timmar. HeLa-systemet är ett idealiskt system för proteinsyntes i laboratoriemiljö översättning. En stor fördel med cellfria expressionssystem humana över andra cellfria system är tillgången av flera olika cellinjer härledda från olika organ och vävnader. Flera varianter av cellfria system kan utformas beroende på cellinjen. Extraktets härrör från däggdjursceller har högre effektivitet för att syntetisera stora proteiner än andra cellfria expressionssystem. Dessa cellfria expressionssystem kan också användas i diagnostiska och proteinkarakterisering tillämpningar såsom mikro arrayer 30. De populära HeLa cellinjer är de mest allmänt används för att utföra uttryckningen av proteiner 33. Det endoplasmatiska retiklet i cellinjerna HeLa är underutvecklad, vilket leder till frånvaro av posttranslationell glykosylering modifiering aktivitet 33. Emellertid är detta system tros vara fördelaktigt för Plasmodium proteinsyntes som Plasmodium saknar också glykosylering översättnings- modifiering 29. Den HeLa cellfria transkriptions translation protokoll är lätt att utföra, billigt och proteiner kan uttryckas i 90 minuter, redo för rening och ytterligare tillämpningar i efterföljande led.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

Malaria orsakar betydande global sjuklighet och dödlighet. Ingen rutin vaccin finns för närvarande. En av de stora anledningarna till bristen på vaccin är utmaningen att identifiera lämpliga vaccinkandidater. Malaria proteiner uttryckas med prokaryota och eukaryota cellbaserade uttryckssystem är dåligt glykosylerade, allmänt olöslig och genomgår felaktig vikning som leder till minskad immunogenicitet. De vetegroddar, kaninretikulocytlysat och Escherichia coli lysat cellfria expressionssystem används idag för uttryck av malaria proteiner. Emellertid förblir längden av expressionstiden och felaktig glykosylering av proteiner fortfarande en utmaning. Vi visar uttryck av Plasmodium proteiner in vitro med hjälp av HeLa baserad cellfria expressionssystem, benämnda &quot;in vitro cellfria expressionssystem mänskliga&quot;. De 2 HeLa baserad cellfria expressionssystem transkribera mRNA i 75 minuter och 3 pl transcribEd-mRNA är tillräckligt för att översätta proteiner i 90 minuter. Den 1-steg uttryckssystem är en transkription och translation kopplad expressionssystem; transkriptionen och co-översättning sker i tre timmar. Processen kan också förlängas med 6 h genom att tillhandahålla ytterligare energi. I två-stegsexpressionssystem, är mRNA transkriberas först och sattes därefter till blandningen översättning av proteinuttryck. Vi beskriver hur man uttrycker malariaproteiner; en hydrofob PF3D7_0114100 Maurer är kluven - 2 trans (PfMC-2TM) protein, en hydrofil PF3D7_0925900 protein och ett bältdjur upprepningar som innehåller protein PF3D7_1361800, med hjälp av HeLa baserade cellfria expressionssystem. Proteinerna uttrycks i mikro volymer som använder två-stegs och en-stegs-expressionsstrategier. En affinitetsreningsmetod för att rena 25 pl av proteiner som uttrycks med användning av in vitro-humana cellfritt expressionssystem beskrivs också. Protein avkastning bestäms av Bradford analysen och den uttrycktaoch renade proteiner kan bekräftas genom western blotting-analys. Uttryckta rekombinanta proteiner kan användas för vaccinationer, immunanalyser och proteinsekvensering.

Validering av de uttryckta rekombinanta proteinerna genom reaktivitet med specifika antikroppar är ett viktigt första steg för att bekräfta korrekt veckning av de uttryckta proteinerna. Rekombinanta malaria proteiner uttrycktes med hjälp av ett steg och två steg in vitro mänsklig cellfria expressionssystem. De rekombinanta proteinerna renas Ni-kelaterande affinitetsmetoden. Vi använde sedan sera mot hela merozoite rhoptries i västra blotting av SDS-PAGE separerade rekombinanta proteiner. <p class="jove_cont...

Watch this Scientific Journal Video about HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins at JoVE.com

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Uttryck av malaria proteiner i cellbaserade system är fortsatt utmanande. Vi visar två steg och ett steg IVT (in vitro-translation) cellfritt expressionssystem för att uttrycka malaria rekombinanta rhoptry proteiner från HeLa-celler. Vi använder ett Ni-hartsaffinitetsbaserade reningssystem för att rena rhoptry proteiner.

HeLa Baserat Cell yttrandefriheten System för uttryck av<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Bedömning av GFP uttryck och livskraft Använda Tali bildbaserade flödescytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskaliga nukleärextrakt för funktionella analyser av genuttryck maskinerier

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration av växter för hög nivå Transient Expression av rekombinanta proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protokoll för Implementera en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Baserad TX-TL Cell-Free Expression System för syntetisk biologi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...