Name: functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

Finansiering fra det amerikanske National Institutes of Health (tilskud R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 og F32 DK103500), CIMIT projekt nr 12-1732 og Shriners Hospitals for Children er taknemmeligt anerkendt. Vi vil gerne takker New England Organ Bank for at understøtte dette arbejde.

Brugen af ​​humane væv skal revideres af en Institutional Review Board (IRB) eller tilsvarende. Den her beskrevne arbejde blev godkendt og erklæret fritaget fra Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (nr 2011P001496). 1. Fremstilling af opløsning <ol><li> Aseptisk tilføje supplementer til phenolrødt-frit Williams &#39;medium E, som er skitseret i tabel 1. Opløsningen skal fremstilles frisk før brugen. Insulin skal tilføjes umiddelbart før brug. </li></ol> 2. Back Table Forberedelse af leveren <ol><li> Placer en isfyldte orgel skål på en steril, draperet overflade. Fjern leveren fra kassen, hvorefter det i posen kold konservering opløsning. Hold leveren meste under vand. </li><li> Identificer den hepatiske arterie (HA), som vil blive placeret distalt i forhold til aorta patch. Skær fri arterien for at afsløre forskellige afskårne grene langs længden ved hjælp af Metzenbaum saks. Omhyggeligt thesect hele længden af ​​arterien for at forhindre overskæring et fartøj, der leverer leveren. Der må ikke skæres eller binde grene, der ikke har en synlig ende. </li><li> Bind off alle arterielle grene ikke leverer leveren ved hjælp silkesutur spænder fra størrelse 0 til 4-0, afhængigt af størrelsen af ​​fartøjet. Luk grene, der er for kort til at binde eller huller i arterien med en søm på 7-0 prolene. Tie og skær milt og venstre gastrisk arterier tæt på deres oprindelse på cøliaki stammen. </li><li> Fjern aorta patch ved at skære cøliaki stammen direkte under plasteret. Kanyler cøliaki stammen ved hjælp af aorta kanyle. </li><li> Identificer portalen vene (PV) og ligeud dissekere det fri. Bind off filialer og kanyle PV med den forberedte segment af størrelse 24 slangen. </li><li> Fjern dele af membranen fra suprahepatic vena cava, uden at skære venen selv. Udvandringen fra vena cava afløb direkte i orglet kammer. </li><li> Skær 2 fuld omkreds tissue prøver (2-3 mm længde) fra enden af ​​den fælles galdegang; snap fryse en i flydende nitrogen (opbevares ved -80 ° C) og gemme den anden i 10% bufret formalin, for væv og histologisk analyse hhv. Kanyler den fælles galdegang med skibet kanyle og et dræn rør fremstillet af membranoxygenatoren slangen. </li><li> Identificere og liger cystisk ventilationskanal med en 0 silkeslips. Galdeblæregangen findes mellem den fælles galdegang og galdeblære. </li><li> Slut flush slange indstillet til iskolde poser af Ringer-laktat (LR) opløsning og prime slangen, fjerne al luft. </li><li> Indstil flow regulator på flush slangen til en langsom sive. Forud for flush slange tilslutning til portvenen kanyle okkludere portvenen med fingrene på hilum og fyld kanylen og vene med flush at fjerne luft fra portvenen. Ikke løfte posen mere end 20 cm over højden af ​​leveren under kold skylning for at undgå for stort tryk påvene. </li><li> Under den flush kort occlude PV på det laveste punkt. Undersøg PV for utætheder. Fartøjets grene kan lukkes som beskrevet ovenfor. Skyl leveren gennem PV med i alt 2 l iskoldt LR. </li><li> Gentag trin 2.10, 2.11 for HA med 1 I LR. </li></ol> 3. Priming SNMP System <ol><li> Prime perfusion enhed ved tilsætning af 2 L af perfusatet (21 ° C) til organet skål og begynder indretningen at prime slangen. Følg enhedens instruktion om at forberede sig til perfusion, indstilling af temperaturen til 21 ° C. Begynd med et tryk på 3 mmHg og 30 mmHg på PV og HA hhv. Åbn gastank og indstillet til et flow på 3 l / min. </li><li> Læs blodgas prøve fra både HA og PV indstrømning ved at tegne en 0,3 ml prøve fra prøven havne og kører den i blodgasanalyse maskine ifølge producentens anvisninger. Bekræft tilstrækkelig iltning (Po 2&gt; 700 mmHg) og pH (7,35-7,45). </li><li> Før leveren er tilsluttet tage en 1,0 ml prøve af perfusatet pr = 0 måling i et Eppendorf-rør og opbevares ved -80 ° C. Skær to ± 250 mg kile biopsier fra leveren ved hjælp af en enægget stål klinge; snap fryse en i flydende nitrogen (opbevares ved -80 ° C) og gemme den anden i 10% pufret formalin. Leveren afvejes før perfusion. </li></ol> 4. Human Liver Perfusion <ol><li> Overfør leveren til enheden. Slut PV tilgangen til PV kanyle, efter fjernelse af luft fra PV som i trin 2.10. Tilslut HA på lignende måde. Indstil PV og HA tryk til 3 og 30 mmHg. Leveren skal næsten oversvømmet af perfusat. Dække eventuelle tørre overflader, herunder tilgangen fartøjer, med våde steril gaze for at forhindre dehydrering </li><li> Lad galde slangen løbe ned i en opsamlingsbeholder. Sørg for åbningen af ​​galde afløb er på niveau med leveren eller lavere for at tillade galde at køre out frit. </li><li> Target strømningshastigheder er 275-325 ml / min.kg og 50-100 ml / min.kg for PV og HA henholdsvis når leveren er opvarmet til 21 ° C. Da hver leveren reagerer forskelligt på perfusion, overvåge strømmen nøje i de første minutter. Øge eller mindske presset på hver af skibene hvis målet flow ikke er nået. Må ikke overstige 50 mmHg på HA og 5 mmHg på PV. </li><li> Prøverne kan tages fra levervæv, perfusatet og galde på præference undersøgere. Vi anbefaler som minimum følgende prøvetagningen regime under perfusion. <ol><li> Vævsbiopsier, n = 2 x 250 mg, hver time. Opbevaring: snap fryse en i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C på lang sigt. Derudover tage en anden biopsi før og efter perfusion og fix i 10% formalin (n = 1) </li><li> Perfusatprøver, n = 2x 1 ml hver 15 min for den første time og hvert 30. minut derefter. Tegn prøver fra PV inflav prøveporten. Opbevaring: -80 ° C på lang sigt. </li><li> Blodgasanalyse af PV og HA tilstrømning, og vena cava udstrømning. n = 3 x 0,3 ml i hver 30 min. Tegn prøver fra både PV og HA-prøve porte. Tegn en 0,3 ml prøve fra vena cava ved at indsætte en sprøjte ind i venen og gælder kører i blodgasanalysator. Brug output for at sikre tilstrækkelig iltning og pH. </li><li> Bile produktion, n = 1 x 1 ml hver time. Visuelt kvantificere galde produktion hver time og tage en prøve fra opsamlingsbeholderen. Forny beholderen efter prøveudtagningen. Opbevaring: tøris og -80 ° C på lang sigt. </li></ol></li><li> Fortsæt perfusion i 3 timer. Overvågning af tryk, pH og iltning og tage stikprøver i hele. Juster han pH ved tilsætning af natriumhydrogencarbonat til perfusatet. </li><li> Ved udgangen af ​​perfusion tage de endelige prøver, når leveren bliver perfunderet. Afbryd leveren og fjern galdegang kanyle. Tag 2 post-perfusion vævsprøver afgaldegang som beskrevet ovenfor til opbevaring ved -80 ° C og i 10% pufret formalin. </li><li> Kassér den menneskelige lever efter ordentlig biohazard retningslinier for bortskaffelse. </li></ol>

<ol>
	<li>Merion, R. M., Pelletier, S. J., Goodrich, N., Englesbe, M. J., Delmonico, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+after+cardiac+death+as+a+strategy+to+increase+deceased+donor+liver+availability.">Donation after cardiac death as a strategy to increase deceased donor liver availability.</a> Ann Surg. 244 (4), 555-562 (2006).</li><li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+machine+preservation+facilitates+successful+transplantation+of+'orphan'+extended+criteria+donor+livers.">Hypothermic machine preservation facilitates successful transplantation of 'orphan' extended criteria donor livers.</a> Am J Transplant. 15, 161-169 (2015).</li><li>Dutkowski, P., Schlegel, A., de Oliveira, M., M&#252;llhaupt, B., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOPE+for+human+liver+grafts+obtained+from+donors+after+cardiac+death.">HOPE for human liver grafts obtained from donors after cardiac death.</a> J Hepatol. 60 (4), 765-772 (2013).</li><li>Dutkowski, P., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutions+to+Shortage+of+Liver+Grafts+for+Transplantation.">Solutions to Shortage of Liver Grafts for Transplantation.</a> Br J Surg. 101 (7), 739-774 (2014).</li><li>Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+Normothermic+Liver+Perfusion:+An+Update.">Ex-vivo Normothermic Liver Perfusion: An Update.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).</li><li>Monbaliu, D., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+Perfusion+of+the+Liver:+Past,+Present,+and+Future.">Machine Perfusion of the Liver: Past, Present, and Future.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 160-166 (2010).</li><li>Matsuno, M., Uchida, K., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Machine+Perfusion+Preservation+of+Liver+Grafts+From+Donation+After+Cardiac+Death.">Impact of Machine Perfusion Preservation of Liver Grafts From Donation After Cardiac Death.</a> Transplant Proc. 46 (4), 1099-1103 (2014).</li><li>Schlegel, A., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypothermic+machine+perfusion+in+liver+transplantation.">Role of hypothermic machine perfusion in liver transplantation.</a> Transplant Int. , (2014).</li><li>Op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers.">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> Am J Transplant. 13, 1327-1335 (2013).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+prophylaxis+in+(sub)normothermic+organ+preservation:+In+vitro+efficacy+and+toxicity+of+cephalosporins.">Antibiotic prophylaxis in (sub)normothermic organ preservation: In vitro efficacy and toxicity of cephalosporins.</a> Transplantation. 95 (8), 1064-1069 (2013).</li><li>Post, I. C., Dirkes, M. C., Heger, M., Bezemer, R., van't Leven, J., van Gulik, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+flow+and+pressure+management+in+machine+perfusion+systems+for+organ+preservation.">Optimal flow and pressure management in machine perfusion systems for organ preservation.</a> Ann Biomed Eng. 40 (12), 2698-2707 (2012).</li><li>Post, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+preservation+at+hypothermic+to+normothermic+conditions+using+clinical+and+experimental+organ+preservation+solutions.">Endothelial cell preservation at hypothermic to normothermic conditions using clinical and experimental organ preservation solutions.</a> Exp Cell Res. 319 (17), 2501-2513 (2013).</li><li>Klein, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Donation+and+Utilization+in+the+United+States,+1999-2008.">Organ Donation and Utilization in the United States, 1999-2008.</a> Am J Transplant. 10 (4), 973-986 (2010).</li><li>Jay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Increased+Costs+of+Donation+After+Cardiac+Death+Liver+Transplantation.">The Increased Costs of Donation After Cardiac Death Liver Transplantation.</a> Ann Surg. 251 (4), 743-748 (2010).</li><li>Seehofer, D., Eurich, D., Veltzke-Schlieker, W., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+Complications+After+Liver+Transplantation:+Old+Problems+and+New+Challenges.">Biliary Complications After Liver Transplantation: Old Problems and New Challenges.</a> Am J Transplant. 13, 253-265 (2013).</li><li>Morrissey, P., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+After+Circulatory+Death:+Current+Practices,+Ongoing+Challenges+and+Potential+Improvement.">Donation After Circulatory Death: Current Practices, Ongoing Challenges and Potential Improvement.</a> Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).</li><li>Verdonk, R., Buis, C., Porte, R., Haagsma, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+complications+after+liver+transplantation:+A+review.">Biliary complications after liver transplantation: A review.</a> Scand J Gastroenterol. 41, 89-101 (2006).</li><li>Pine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Transplantation+Following+Donation+After+Cardiac+Death:+An+Analysis+Using+Matched+Pairs.">Liver Transplantation Following Donation After Cardiac Death: An Analysis Using Matched Pairs.</a> Liver Transpl. 15 (9), 1072-1082 (2009).</li><li>Sutton, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+for+viability+assessment+of+discarded+human+donor+livers+during+ex+vivo+normothermic+machine+perfusion.">Criteria for viability assessment of discarded human donor livers during ex vivo normothermic machine perfusion.</a> PLoS One. 11, e110642 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnormothermic+Machine+Perfusion+for+Ex+Vivo+Preservation+and+Recovery+of+the+Human+Liver+for+Transplantation.">Subnormothermic Machine Perfusion for Ex Vivo Preservation and Recovery of the Human Liver for Transplantation.</a> Am J Transplant. 14, 1400-1409 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., Yarmush, M. L., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organomatics+and+organometrics:+Novel+platforms+for+long-term+whole-organ+culture.">Organomatics and organometrics: Novel platforms for long-term whole-organ culture.</a> Technology. 02 (1), 13-22 (2014).</li><li>Berendsen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+subnormothermic+machine+perfusion+system+restores+ischemically+damaged+liver+grafts+in+a+rat+model+of+orthotopic+liver+transplantation.">A simplified subnormothermic machine perfusion system restores ischemically damaged liver grafts in a rat model of orthotopic liver transplantation.</a> Transplant Res. 1 (1), 6 (2012).</li></ol>

Drs. BE Uygun, K Uygun og Yarmush er opfindere på en verserende patent, der er relevante for denne undersøgelse (WO / 2011/002926), og Drs. BE Uygun, K Uygun og Yarmush er opfindere på en verserende patent, der er relevante for denne undersøgelse (WO / 2011/35223). Drs. K Uygun og Bruinsma har en foreløbig patentansøgning relateret til dette arbejde. Dr. K Uygun og BE Uygun have en økonomisk interesse i Organ Solutions, en virksomhed med fokus på udvikling af orgel bevarelse teknologi. Dr. K Uygun og BE Uygun interesser forvaltes af MGH og Partners HealthCare i overensstemmelse med deres interessekonflikter politikker.

I et forsøg på at genvinde lever såret under iskæmi udviklede vi en SNMP system, der kan anvendes efter en periode med kold opbevaring. Subnormothermic maskine perfusion tilbyder et levedygtigt alternativ til konventionel fryselager, samt hypotermiske og normotermiske maskine perfusion modaliteter. Der findes forskellige systemer; alle tilbyder forskellige fordele og ulemper 3,9,20. SNMP tillader perfusion uden ilt bærer, som metaboliske oxygenbehov ved 21 ° C opfyldes ved aktiv iltning af perfusatet. Selvom reduceret under subnormothermic betingelser, stofskifte er væsentlig og kræver støtte fra en næringsrig perfusionsopløsning. Traditionelle perfusionsopløsninger såsom Belzer maskine perfusion opløsning, er generelt minimal i sammensætning og er beregnet til koldt perfusion. Williams &#39;Medium E er blevet brugt som en hepatocyt dyrkningsmedium i mange år, og indeholder Components der er universelle for at støtte cellefunktion, især under varme ex vivo forhold. Målinger foretaget i maskine perfusion er reflekterende af funktionen af ​​orglet. Direkte observerbare parametre såsom galde produktion og iltoptagelse er realtidsmålinger, der kan anvendes til at vurdere leveren før transplantation. Ligeledes kan måles markører for cellulær skade og iskæmi (K +, lactat frigivelse) direkte i perfusionsopløsningen og kan være tegn på organfunktion 20. Som maskine perfusion teknologi udvikler sig yderligere og opnår mere udbredt klinisk anvendelse, kan præcise sammenhænge mellem ex vivo funktion og kliniske resultater skal foretages, og perfusion parametre vil være nyttige i medvirken beslutninger at omplante eller afvise marginal kvalitet lever. Som punkt-pleje analyseredskaber forvejen, vil mere avanceret analyse bliver tilgængelige direkte under maskinen perfuning 21. I dette arbejde viser vi, at lever kan støttes i SNMP-system med minimal skade på leveren, hvilket afspejles ved histologi og frigivelse af ALT. Funktionel genopretning af leveren er bedst til udtryk i ATP, som har vist sig at korrelere til leveren levedygtighed og er stærkt tyder på transplantation succes i dyremodeller 22. Ex vivo og præ-transplantation inddrivelse af leveren transplantater ville tillade en betydelig udvidelse af donoren liver pool, korrigere forskellen mellem udbud og efterspørgsel af donor lever i transplantation.

Lever transplantation er den eneste helbredende behandling for titusinder af patienter, der lider af slutstadiet leversygdom. For at lette en vellykket transplantation, optimal bevarelse af leveren fra den tid, det er indkøbt fra donoren og til den er implanteret i modtageren er nødvendigt for at forhindre hurtig forværring af transplantatet. Den nuværende standard for leveren konservering kaldes &quot;statisk fryselager«: leveren afkøles i en iskold konservering løsning, og derved reducere stofskiftet i leveren og bremse de skadelige virkninger af iskæmi. Selv om denne køle- teknik har gjort det muligt for en vellykket transplantation, organer marginal kvalitet som DCD organer beskadiget af varme iskæmi eller steatose show ringere patient resultater 1. Der er en hastigt voksende mængde af beviser, som ex vivo maskine perfusion af leveren transplantater som alternativ konservering modalitet kan potentielt imbevise resultater for disse marginale organer 2,3. Lever transplantation er blevet et offer for sin egen succes. Langt flere patienter henvises til transplantation, end der er lever rådighed, og tusinder dør på ventelisten i USA hvert år. I betragtning af den virkelighed af donor leveren mangel og den stigende udnyttelse af leveren transplantater af suboptimal kvalitet til trængende modtagere, er det en udbredt opfattelse, at ex vivo maskine perfusion af leveren transplantater før implantation giver løfte om et paradigmeskift i levertransplantation. Der har været en markant stigning i forskning interesse i dette emne i de seneste år 4-8. I forskellige europæiske og nordamerikanske centre hypotermisk maskine perfusion har foretaget en klinisk introduktion 8 og normotermisk maskine perfusion ved fysiologiske temperaturer er for nylig blevet anvendt på kasserede menneskelige lever og bliver oversat til klinisk brug samt 9.Omfattende udvikling har ført til udviklingen af forskellige protokoller, mens kontinuerlig optimering identificerer den optimale perfusion parametre 10-12. Anvendelse af marginal kvalitet podninger er steget mere end 10 gange i det seneste årti 13. Sammenlignet med den nuværende standard for leveren konservering (statisk kølerum), ex vivo maskine perfusion giver mange potentielle fordele, som alle resulterer i tiltrængt udvidelse af orglet pool og et potentielt fald i forekomsten af post-transplantations komplikationer. Især galde komplikationer, der i øjeblikket plager suboptimal kvalitet lever transplantater efter transplantation forblive en væsentlig faktor 14-18. Machine perfusion ved subnormothermic betingelser giver et tidsvindue til at vurdere transplantatfunktion objektivt som til egnethed til transplantation 19. Mens leveren bliver perfunderet i en ex vivo kredsløb, både perfusatet ennd kan tages prøver af galde produceret under perfusion til måling af markører for organfunktion. På denne måde &quot;alvorligt kompromitteret&quot; lever, der er kasseret til transplantation under de nuværende kriterier kan vurderes objektivt om deres egnethed til transplantation. Levedygtighed vurdering potentielt giver mulighed for mange af disse organer, som skal anvendes til transplantation. En lige så kraftfuld fordel af maskinens perfusion er reparation og forbedring af lever, der er blevet beskadiget af varm / kold iskæmi. ATP er tømt meget hurtigt under varmt og efterfølgende kold iskæmi og kan repleted i en periode på maskine perfusion før implantation af leveren 20. Leveren, med sin energi butikker og metabolisk tilstand genopfyldes er forkonditioneres og bedre forberedt på de skadelige virkninger af reperfusionsskade efter implantation i modtageren. Dette arbejde beskriver en fremgangsmåde til ex vivo maskine perfusion af human lever grafts i laboratoriet, som vil være nyttige for forskere, der ønsker at studere både teknikken og gavnlige virkninger af ex vivo maskine perfusion. Vi gør brug af menneskelige donorer lever, der er faldet til transplantation og derefter afsat til forskningsformål. Standard lever indkøb teknik indebærer in situ arteriel flush af leveren efter aorta cross-fastspænding i hjernen døde donorer (DBD) eller efter kredsløbssygdomme anholdelse i kredsløbssygdomme død donorer (DCD), som er beskrevet mere detaljeret andetsteds 20. Derudover er leveren afkøles under isoleringen ved at fylde donorens bughulen med is. Skyl løsning præferencer varierer mellem regioner, med de fleste indkøb ved hjælp af University of Wisconsin eller histidin-tryptophan-ketoglutarat (HTK) løsning. En yderligere back-tabel flush af portvenen forbedrer udvaskning af overskydende blod. Lever ofte indkøbes forlader en aorta segment surafrunding af cøliaki stammen. Galdeblæren indsnit, galde aspireres, og galdegangen skylles. De lever er pakket i sterile poser med iskold bevarelse løsning og transporteres i udpegede kasser eller kølere. For repræsentative resultater varm og kold iskæmi tid bør begrænses til 60 min og 12 hr hhv. Trods rutinemæssige serologiske screening for overførbare patogener, skal standard forholdsregler skal træffes, når uddele menneskelige organer, prøver fra menneskelige organer og eventuelle affaldsstoffer. Protokollen her beskriver subnormothermic maskine perfusion ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt lever perfusion enhed. Anvendelse af en sådan anordning muliggør hurtigere oversættelse til det kliniske miljø og krydsvalidering af forskellige protokoller og enhedsindstillinger blandt forskningsgrupper og transplantationscentre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Assist perfusion device</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Assist disposable set</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist disposable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1878&#8211;6x500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co</td>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>MGH pharmacy</td>
			<td>7750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ZO2OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty gas regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y11244D580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2324X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>316-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Adson forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debakey tissue forceps, 7.75&#8221;, 2.25 mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors 7&#34; Curved SureCut Tungsten</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6965SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle holder 5.5&#8211;7&#8221;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 blackbraided silk sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA66G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>C554D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood gas analysis machine</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidPoint 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance scale</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-10000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure display box</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pressure display sets</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>61000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td colspan="2">EW-91500-04 and EW-08516-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>30005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irrigation set flush tubing</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>06543-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing bowl, 4L</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07300-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

En række observationer og analyser kan udføres på leveren under perfusion, herunder direkte tidstro observationer, såsom strømningshastigheder og galde produktion; realtidsmålinger, såsom gas analyse af perfusatet, og post-hoc-målinger, der er foretaget efter prøvetagning, herunder biokemiske analyser af perfusatet og væv og histologisk analyse. Resultater, der er nævnt her, er fra 22 perfuseres menneskelige lever. Lever blev afvist til transplantation af forskellige årsager, herunder donor alder, overdreven varme iskæmisk tid, biopsi resultater (steatosis, inflammation, fibrose) og af logistiske grunde. 18 lever blev indkøbt efter hjertedød, og 4 efter hjernedød. I begge tilfælde blev donorer forbehandlet med 30.000 enheder heparin og skylles in situ og på bagsiden bordet med UW opløsning. Mean kold iskæmisk tid var 531 ± 237 (SD) min, og den gennemsnitlige varme iskæmisk tid var 27 ± 10 (SD) min, målt fra tilbagetrækning af livstøtte til kold flush. Realtid observationer og målinger kan anvendes til at vurdere leveren under perfusion, mens post-hoc-målinger afsløres efter perfusion. Real time observationer Flow gennem leveren begynder lavere end målet strømningshastigheder, som et resultat af en højere modstand i den kolde leveren. Ved hjælp af et tryk på 3 mmHg på PV og 30 mmHg på HA kan generelt nået målet strømme, når leveren er varmet op til 21 &#160; ° C efter 60 min perfusion (figur 1A). Kan generelt iagttages Galdeflow inden for 10 min perfusion og produceres støt under perfusion (figur 1B). Bile mængde afhænger af kvaliteten af ​​leveren og varierer fra 0,3 ml / time / kg leveren til 18 ml / min / kg. I lever med længere varm iskæmisk tid, vil galde flow tendens til at aftage, mens kortere varme iskæmisk tid resulterer i en mere stabil eller endog stigendegalde produktion. Real time målinger Direkte og hyppig måling af perfusatet ved blodgasanalyse i afgørende for både forsøgsøjemed samt opretholde tilstrækkelig perfusion, vigtigere iltning og pH. Opløst ilt partialtryk bør være større end 700 mmHg på tilstrømningen af ​​både PV og HA. Udstrømning ilt pres, målt i vena cava, generelt falder med længere perfusion, hvilket afspejler en stigende iltoptagelsen. Iltoptagelse kan beregnes som tidligere beskrevet 13 og varierede fra 0,5 til 2,2 ml O 2 / min / kg ved begyndelsen af perfusion til 2,4-9,7 ml O 2 / min / kg ved t = 3 timer (figur 1C). Et fald i pH er observeret i de første 30 min (figur 1D), primært som følge af laktat frigivelse i perfusatet. Dette kan understøttes af tilskud med 8,4% natrium bicarbonate og efter omkring 90 min pH falder tilbage i normalområdet. Sædvanligvis er 30-50 ml 8,4% natriumbicarbonat påkrævet. Lactatkoncentration stiger hurtigt i de første 15-30 min, men begynder at decease efter den første time (figur 1E). Post-hoc-målinger Kan måles levertransaminaser såsom ALT i perfusatet. I de første 30 minutter en stor stigning af ALT er generelt observeret som afspejler udvaskning af ALT, der blev udgivet under iskæmi (figur 1F). ALT blev vist at korrelere godt med varmt iskæmisk tid 13. Machine perfusion forøget ATP-indhold 2,8 gange, hvilket afspejler et opsving energi status (figur 1G). H &amp; E histologisk analyse afslører ingen yderligere skade under maskinen perfusion (Figur 1 H, I). Det skal bemærkes, at biopsi regime foreslås i denne protokol for research formål og må ikke anvendes til kliniske formål. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figur 1:. Vurdering af menneskelige lever under maskine perfusion Flow gennem PV og HA i SNMP (A), galde produktion, kvantificeret i timen af perfusion (B), ilt uprate rate (OUR), beregnes ud fra forskellen i tilgangen (PV + HA) og udstrømning (vena cava), afbrudt linjer viser partielle ilt tryk i ind- og udbetalinger under perfusion (C), pH og laktat under perfusion (D, E), frigivelse af ALT i perfusatet (F), ATP Indholdet målt i væv fra time biopsier (G) og H &amp; E pletter i leveren (54 år gamle DCD, 19 min varm iskæmi, 559 min kold iskæmi) før (H) og efter (I) perfusion. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Vi beskriver en fremgangsmåde til ex vivo maskine perfusion af humane lever transplantater ved subnormothermic temperatur (21 ° C).

Funktionel Human Liver Beskyttelse og inddrivelse af beløb ved Subnormothermic Machine Perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Teknik Subnormothermic<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lever Perfusionen til opbevaring, vurdering og reparation af marginale Liver transplantater

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Menneskerettigheder saphenous Veins<em&gt; Ex vivo</em&gt; Perfusion og udvendig forstærkning

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isoleret Nedsat Perfusion som en behandling for levermetastaser af Uveal melanom

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex vivo</em&gt; Nyre Perfusion for Bevarelse af Nyre grafts før Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering af en humaniseret Mouse Lever Brug humane lever Stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Metode til direkte Segmentoplysninger Intra-hepatisk Levering Ved hjælp af en rotte Lever hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En lille dyremodel af Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

Dynamisk navigation i endodonti: Guidet adgang hulrum forberedelse ved hjælp af et miniaturiseret navigationssystem

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic ex vivo pancreas perfusion til bevarelse af bugspytkirtlen allotransplantater før transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...