Name: functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

De financiering van de Amerikaanse National Institutes of Health (verleent R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 en F32 DK103500), Cimit Project No. 12-1732 en de Shriners Hospitals for Children is dankbaar erkend. We willen graag dankbaar erkennen de New England Organ Bank voor de ondersteuning van dit werk.

Het gebruik van menselijk weefsel moeten worden beoordeeld door een Institutional Review Board (IRB) of gelijkwaardig. De hier beschreven werk werd goedgekeurd en vrijgesteld van het Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (No. 2011P001496) verklaard. 1. Oplossing Voorbereiding <ol><li> Aseptisch aanvullingen aan fenol rood-vrij Williams medium E zoals aangegeven in tabel 1. De oplossing moet vóór gebruik vers worden bereid. Insuline moet vlak voor gebruik worden toegevoegd. </li></ol> 2. Terug Tabel Voorbereiding van de lever <ol><li> Een-ijs gevulde orgel kom op een steriele, gedrapeerd oppervlak. Verwijder de lever van de doos, waardoor het in de zak koude preservatievloeistof. Houd de lever meestal ondergedompeld. </li><li> Identificeer de leverslagader (HA), die distale zal worden gevestigd aan de aorta-patch. Ontleden gratis de slagader naar verschillende cut takken langs de lengte met behulp van Metzenbaum schaar onthullen. Zorgvuldig dissect de gehele lengte van de arterie verbreken een vaartuig dat de lever levert voorkomen. Niet snijden of bind takken die niet beschikken over een zichtbare einde. </li><li> Bind alle arteriële takken niet verstrekken van de lever met behulp van zijden hechtdraad variërend van maat 0 tot 4-0, afhankelijk van de grootte van het schip. Sluiten takken die te kort te binden zijn of gaten in de slagader met een steek van 7-0 prolene. Stropdas en snijd de milt en linker maag slagaders dicht bij hun oorsprong op de coeliakie kofferbak. </li><li> Verwijder de aorta patch door het snijden van de coeliakie romp direct onder de patch. Canule coeliakie stam met de aorta canule. </li><li> Identificeer de poortader (PV) en botweg ontleden gratis. Afhechten dat takken en canule de PV met de voorbereide segment van de grootte 24 buizen. </li><li> Verwijder gedeelten van het membraan van de suprahepatic vena cava, zonder dat de ader zelf. Uitstroom uit de vena cava riool direct in de orgaankamer. </li><li> Snijd 2 full-omtrek tissue monsters (2-3 mm lengte) van het uiteinde van de galwegen; snap bevriezen één in vloeibare stikstof (bewaar bij -80 ° C) en bewaar de andere 10% gebufferde formaline, weefsels en histologische analyse, respectievelijk. Canule de galwegen met het schip de canule en een afvoerbuis gemaakt van membraanoxygenator buizen. </li><li> Identificeren en afbinden van de cystic duct met een 0 zijden stropdas. De galblaasbuis wordt gevonden tussen de galwegen en de galblaas. </li><li> Sluit de flush slangen ingesteld op ijskoud zakken van Ringerlactaat (LR) oplossing en prime de slang, het verwijderen van alle lucht. </li><li> Zet de stroom regulator op de flush slang aan op een trage straaltje. Voorafgaand aan het aansluiten van de flush slang aan op de poortader canule, af te sluiten de poortader met de vingers in de navel en vul de canule en ader met flush om de lucht uit de poortader te verwijderen. Niet verheffen de zak meer dan 20 cm boven de hoogte van de lever tijdens koude spoelen overdruk op het voorkomenader. </li><li> Tijdens de flush kort af te sluiten van de PV op het laagste punt. Onderzoek de PV op lekkage. Vaartuig takken kunnen worden afgesloten zoals hierboven beschreven. Spoel de lever door de PV met in totaal 2 liter ijskoud LR. </li><li> Herhaal stap 2.10, 2.11 voor de HA met 1 L LR. </li></ol> 3. Verzadiging van de SNMP-System <ol><li> Prime de perfusie apparaat door 2 L perfusievloeistof (21 ° C) het orgaan kom en begint het apparaat de slang te primen. Volg instructies van het apparaat voor te bereiden perfusie, het instellen van de temperatuur tot 21 ° C. Begin met drukken van 3 mmHg en 30 mmHg op de PV en HA, resp. Open de gastank en op een stroom van 3 l / min. </li><li> Neem een ​​bloedgas monster uit zowel de HA en PV instroom uit door een 0,3 ml monster van de monsterpoorten en actief in de bloedgasanalyse machine volgens de instructies van de fabrikant. Bevestig voldoende zuurstofverzadiging (pO 2&gt; 700 mmHg) en pH (7,35-7,45). </li><li> Voordat de lever is aangesloten eens 1,0 ml van het perfusaat per = 0 Meting een eppendorf buisje en bewaar bij -80 ° C. Snijd twee ± 250 mg wig biopten van de lever met behulp van een single-edged stalen blad; snap bevriezen één in vloeibare stikstof (bewaar bij -80 ° C) en bewaar de andere 10% gebufferde formaline. Weeg de lever voordat perfusie. </li></ol> 4. Menselijke leverperfusie <ol><li> Breng de lever het apparaat. Sluit de PV aanvoer naar de PV canule na het ontluchten van de PV zoals in stap 2.10. Sluit de HA soortgelijke wijze. Stel PV en HA druk 3 en 30 mmHg. De lever moet bijna worden overspoeld door perfusaat. Bedek elke droge oppervlakken, inclusief de instroom schepen, met natte steriel gaasje om uitdroging te voorkomen </li><li> Laat de gal buis drain in een opvangbak. Zorg ervoor dat de opening van de gal afvoer is ter hoogte van de lever of lager om gal te draaien out vrij. </li><li> Target stroomsnelheden respectievelijk 275-325 ml / min.kg en 50-100 ml / min.kg voor de PV en HA zodra de lever opgewarmd tot 21 ° C. Aangezien elke lever reageert anders op perfusie, het toezicht op de stroom nauw tijdens de eerste minuten. Verhogen of verlagen van de druk op een van de vaten als het doel debieten niet worden bereikt. Niet meer dan 50 mmHg op de HA en 5 mmHg op de PV. </li><li> Monsters worden genomen van het leverweefsel, perfusaat en gal bij de onderzoekers voorkeur. Wij raden aan om minimaal de volgende monstername regime tijdens perfusie. <ol><li> Weefselbiopten n = 2 x 250 mg, per uur. Opslag: snap bevriezen een in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C langdurig. Bovendien neemt een biopsie voor en na perfusie en oplossen in 10% gebufferde formaline (n = 1) </li><li> Perfusaatmonsters, n = 2 x 1 ml, elke 15 min gedurende het eerste uur en elke 30 minuten daarna. Monsters van de PV-inflage monster poort. Opslag: -80 ° C langdurig. </li><li> Bloed gas analyse van PV en HA instroom, en vena cava uitstroom. n = 3 x 0,3 ml, elke 30 min. Monsters van zowel de PV en HA monster poorten. Teken een 0,3 ml monster uit de vena cava door het invoegen van een spuit in de ader en direct uit te voeren in het bloed gas analyzer. Gebruik de uitgang om voldoende zuurstof en pH te verzekeren. </li><li> Bile productie, n = 1 x 1 ml, elk uur. Visueel kwantificeren gal productie elk uur en neem een ​​monster uit de collectie container. Vernieuw de container na de bemonstering. Opslag: droog ijs en -80 ° C op lange termijn. </li></ol></li><li> Verder perfusie gedurende 3 uur. Het bewaken van de druk, pH en de zuurstofvoorziening en het nemen van monsters in heel. Stel de pH door toevoeging hij natriumbicarbonaat aan het perfusaat. </li><li> Aan het einde van de perfusie neemt de eindmonsters terwijl de lever wordt geperfundeerd. Koppel de lever en verwijder de galwegen canule. Neem 2 post-perfusie weefselmonsters van degalgang zoals eerder beschreven voor opslag bij -80 ° C en in 10% gebufferde formaline. </li><li> Gooi de menselijke lever volgende juiste biohazard richtlijnen voor afvalverwerking. </li></ol>

<ol>
	<li>Merion, R. M., Pelletier, S. J., Goodrich, N., Englesbe, M. J., Delmonico, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+after+cardiac+death+as+a+strategy+to+increase+deceased+donor+liver+availability.">Donation after cardiac death as a strategy to increase deceased donor liver availability.</a> Ann Surg. 244 (4), 555-562 (2006).</li><li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+machine+preservation+facilitates+successful+transplantation+of+'orphan'+extended+criteria+donor+livers.">Hypothermic machine preservation facilitates successful transplantation of 'orphan' extended criteria donor livers.</a> Am J Transplant. 15, 161-169 (2015).</li><li>Dutkowski, P., Schlegel, A., de Oliveira, M., M&#252;llhaupt, B., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOPE+for+human+liver+grafts+obtained+from+donors+after+cardiac+death.">HOPE for human liver grafts obtained from donors after cardiac death.</a> J Hepatol. 60 (4), 765-772 (2013).</li><li>Dutkowski, P., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutions+to+Shortage+of+Liver+Grafts+for+Transplantation.">Solutions to Shortage of Liver Grafts for Transplantation.</a> Br J Surg. 101 (7), 739-774 (2014).</li><li>Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+Normothermic+Liver+Perfusion:+An+Update.">Ex-vivo Normothermic Liver Perfusion: An Update.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).</li><li>Monbaliu, D., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+Perfusion+of+the+Liver:+Past,+Present,+and+Future.">Machine Perfusion of the Liver: Past, Present, and Future.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 160-166 (2010).</li><li>Matsuno, M., Uchida, K., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Machine+Perfusion+Preservation+of+Liver+Grafts+From+Donation+After+Cardiac+Death.">Impact of Machine Perfusion Preservation of Liver Grafts From Donation After Cardiac Death.</a> Transplant Proc. 46 (4), 1099-1103 (2014).</li><li>Schlegel, A., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypothermic+machine+perfusion+in+liver+transplantation.">Role of hypothermic machine perfusion in liver transplantation.</a> Transplant Int. , (2014).</li><li>Op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers.">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> Am J Transplant. 13, 1327-1335 (2013).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+prophylaxis+in+(sub)normothermic+organ+preservation:+In+vitro+efficacy+and+toxicity+of+cephalosporins.">Antibiotic prophylaxis in (sub)normothermic organ preservation: In vitro efficacy and toxicity of cephalosporins.</a> Transplantation. 95 (8), 1064-1069 (2013).</li><li>Post, I. C., Dirkes, M. C., Heger, M., Bezemer, R., van't Leven, J., van Gulik, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+flow+and+pressure+management+in+machine+perfusion+systems+for+organ+preservation.">Optimal flow and pressure management in machine perfusion systems for organ preservation.</a> Ann Biomed Eng. 40 (12), 2698-2707 (2012).</li><li>Post, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+preservation+at+hypothermic+to+normothermic+conditions+using+clinical+and+experimental+organ+preservation+solutions.">Endothelial cell preservation at hypothermic to normothermic conditions using clinical and experimental organ preservation solutions.</a> Exp Cell Res. 319 (17), 2501-2513 (2013).</li><li>Klein, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Donation+and+Utilization+in+the+United+States,+1999-2008.">Organ Donation and Utilization in the United States, 1999-2008.</a> Am J Transplant. 10 (4), 973-986 (2010).</li><li>Jay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Increased+Costs+of+Donation+After+Cardiac+Death+Liver+Transplantation.">The Increased Costs of Donation After Cardiac Death Liver Transplantation.</a> Ann Surg. 251 (4), 743-748 (2010).</li><li>Seehofer, D., Eurich, D., Veltzke-Schlieker, W., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+Complications+After+Liver+Transplantation:+Old+Problems+and+New+Challenges.">Biliary Complications After Liver Transplantation: Old Problems and New Challenges.</a> Am J Transplant. 13, 253-265 (2013).</li><li>Morrissey, P., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+After+Circulatory+Death:+Current+Practices,+Ongoing+Challenges+and+Potential+Improvement.">Donation After Circulatory Death: Current Practices, Ongoing Challenges and Potential Improvement.</a> Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).</li><li>Verdonk, R., Buis, C., Porte, R., Haagsma, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+complications+after+liver+transplantation:+A+review.">Biliary complications after liver transplantation: A review.</a> Scand J Gastroenterol. 41, 89-101 (2006).</li><li>Pine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Transplantation+Following+Donation+After+Cardiac+Death:+An+Analysis+Using+Matched+Pairs.">Liver Transplantation Following Donation After Cardiac Death: An Analysis Using Matched Pairs.</a> Liver Transpl. 15 (9), 1072-1082 (2009).</li><li>Sutton, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+for+viability+assessment+of+discarded+human+donor+livers+during+ex+vivo+normothermic+machine+perfusion.">Criteria for viability assessment of discarded human donor livers during ex vivo normothermic machine perfusion.</a> PLoS One. 11, e110642 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnormothermic+Machine+Perfusion+for+Ex+Vivo+Preservation+and+Recovery+of+the+Human+Liver+for+Transplantation.">Subnormothermic Machine Perfusion for Ex Vivo Preservation and Recovery of the Human Liver for Transplantation.</a> Am J Transplant. 14, 1400-1409 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., Yarmush, M. L., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organomatics+and+organometrics:+Novel+platforms+for+long-term+whole-organ+culture.">Organomatics and organometrics: Novel platforms for long-term whole-organ culture.</a> Technology. 02 (1), 13-22 (2014).</li><li>Berendsen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+subnormothermic+machine+perfusion+system+restores+ischemically+damaged+liver+grafts+in+a+rat+model+of+orthotopic+liver+transplantation.">A simplified subnormothermic machine perfusion system restores ischemically damaged liver grafts in a rat model of orthotopic liver transplantation.</a> Transplant Res. 1 (1), 6 (2012).</li></ol>

Drs. BE Uygun, K Uygun en Yarmush zijn uitvinders op een patent dat aan deze studie (WO / 2011 / 002.926), en drs relevant is. BE Uygun, K Uygun en Yarmush zijn uitvinders op een patent dat aan deze studie (WO / 2011/35223) relevant is. Drs. K Uygun en Bruinsma hebben een voorlopige octrooiaanvraag voor dit werk. Dr K Uygun en BE Uygun een financieel belang in Organ Solutions, een bedrijf dat zich toelegt op het ontwikkelen van preservatie technologie. Dr K Uygun en BE belangen Uygun&#39;s worden beheerd door de MGH en Partners HealthCare in overeenstemming met hun beleid van belangenverstrengeling.

In een poging levers gewond tijdens ischemie herstellen ontwikkelden we een SNMP systeem dat kan worden toegepast na een periode van koude opslag. Subnormothermic machine perfusie biedt een levensvatbaar alternatief voor de conventionele koude opslag, evenals onderkoeld en normotherme machine perfusie modaliteiten. Er bestaan ​​verschillende systemen; Alle bieden verschillende voordelen en nadelen 3,9,20. SNMP maakt perfusie zonder zuurstofdrager, metabolische zuurstofverbruik 21 ° C worden voldaan door actieve zuurstofvoorziening van het perfusaat. Hoewel verminderd onder subnormothermic omstandigheden, het metabolisme is aanzienlijk en vereist de steun van een voedselrijke perfusie oplossing. Traditionele perfusie-oplossingen, zoals de Belzer machine perfusievloeistof, algemeen minimaal samenstelling en zijn ontworpen voor koude perfusie. Williams Medium E is gebruikt als een hepatocyt kweekmedium voor vele jaren, en bevat CSPECTEN dat universeel voor de ondersteuning van cellulaire functie, in het bijzonder onder warme ex vivo omstandigheden zijn. Metingen tijdens machine perfusie weerspiegelt de werking van het orgaan. Direct waarneembare parameters zoals gal productie en zuurstofopname zijn realtime metingen die kunnen worden gebruikt om de lever pre-transplantatie beoordelen. Evenzo kunnen markers van celbeschadiging en ischemie (K +, lactaat release) direct worden gemeten in de perfusievloeistof kan erop wijzen orgaanfunctie 20 zijn. Als machine perfusie technologie zich verder ontwikkelt en realiseert meer wijdverspreid klinische toepassing, kan een nauwkeurige correlaties tussen ex vivo functie en klinische uitkomst worden gemaakt en perfusieparameters zal nuttig zijn in het helpen beslissingen te verplanten of marginale kwaliteit levers verwerpen. Bovendien, als point-of-care analytische instrumenten vooraf, meer verfijnde analyse zal beschikbaar komen direct in de machine Japanse productesie 21. In dit werk wordt aangetoond dat levers kunnen worden ondersteund in de SNMP systeem met minimale schade aan de lever, gereflecteerd door histologie en afgifte van ALT. Functioneel herstel van de lever het best blijkt uit ATP, waarvan is aangetoond dat zij de levensvatbaarheid lever en sterk suggestief succes transplantatie in diermodellen 22. Ex vivo en pre-transplantatie herstel van de lever transplantaten zou een aanzienlijke uitbreiding van de donor toestaan lever zwembad, het corrigeren van de kloof tussen vraag en aanbod van donorlevers bij transplantatie.

Levertransplantatie is de enige curatieve behandeling tienduizenden patiënten met eindstadium leverziekte. Om succesvolle transplantatie, optimaal behoud van de lever van de tijd die is verkregen van de donor tot de tijd wordt geïmplanteerd in de ontvanger nodig snelle verslechtering van het transplantaat te voorkomen vergemakkelijken. De huidige standaard voor leverpreservatie zogenaamde &quot;statische koude opslag&quot;: de lever wordt afgekoeld in een ijs-koude conserveringsoplossing, waarbij het metabolisme van de lever verminderen en vertragen van de schadelijke effecten van ischemie. Hoewel dit koude opslag techniek heeft het mogelijk gemaakt voor een succesvolle transplantatie, organen van marginale kwaliteit zoals DCD organen beschadigd door warme ischemie of steatose tonen inferieure patient outcomes 1. Er is een snel groeiende hoeveelheid bewijs dat ex vivo machine perfusie van de lever enten als alternatief behoud modaliteit kan potentieel imbewijzen de resultaten voor deze marginale organen 2,3. Levertransplantatie heeft een slachtoffer van zijn eigen succes geworden. Veel meer patiënten worden verwezen voor transplantatie dan er levers beschikbaar en duizenden sterven op de wachtlijst in de Verenigde Staten elk jaar. Gezien de realiteit van de donorlever tekort en het toenemende gebruik van de lever transplantaties van suboptimale kwaliteit voor behoeftige ontvangers, wordt algemeen geoordeeld dat ex vivo machine perfusie van de lever transplantaties vóór implantatie houdt de belofte van een paradigmaverschuiving in levertransplantatie. Er is een duidelijke toename van het onderzoek belangstelling voor dit onderwerp in de afgelopen jaren 4-8. In verschillende Europese en Noord-Amerikaanse centra hypotherme machine perfusie heeft gemaakt van een klinische introductie 8 en normotherme machine perfusie bij fysiologische temperaturen is onlangs toegepast op afgedankte menselijke lever en wordt vertaald naar de klinische gebruik, bij 9.Uitgebreide ontwikkeling heeft geleid tot de ontwikkeling van verschillende protocollen, terwijl continue optimalisatie identificeert de optimale perfusie parameters 10-12. Gebruik van marginale kwaliteit transplantaten toegenomen meer dan 10 keer in het afgelopen decennium 13. Vergeleken met de huidige norm voor leverpreservatie (statische koude opslag), ex vivo machine perfusie biedt talrijke voordelen, die leiden veelgevraagde uitbreiding van het orgaan en een potentieel verminderen van de incidentie van complicaties na transplantatie. Vooral de biliaire complicaties die momenteel pest suboptimale kwaliteit levertransplantatie transplantaten na transplantatie blijven belangrijk punt 14-18. Machine perfusie bij subnormothermic omstandigheden biedt een tijdsvenster om graft function objectief te beoordelen op geschiktheid voor transplantatie 19. Terwijl de lever wordt geperfuseerd in een ex vivo circuit zowel het perfusaat eennd de gal die tijdens perfusie kan worden bemonsterd voor het meten van merkers van orgaanfunctie. Op deze manier &#39;ernstig aangetast&#39; levers die worden weggegooid voor transplantatie onder de huidige criteria objectief kan worden beoordeeld op hun geschiktheid voor transplantatie. Levensvatbaarheidsbeoordeling mogelijk maakt veel van deze organen worden gebruikt voor transplantatie. Een even krachtige voordeel van de machine perfusie is reparatie en verbetering van levers die zijn beschadigd door warme / koude ischemie. ATP is zeer snel uitgeput tijdens warme en daaropvolgende koude ischemie en gedurende machine perfusie vóór implantatie van de lever 20 worden repleted. De lever, met zijn energie opslaat en metabole toestand bijgevuld, wordt geconditioneerd en beter voorbereid voor de schadelijke gevolgen van reperfusie schade na implantatie in de ontvanger. Dit werk beschrijft een methode voor ex vivo machine perfusie van menselijke lever grafts in het laboratorium, die nuttig voor onderzoekers die willen zowel de techniek en de gunstige effecten van ex vivo machine perfusie bestuderen zijn. Wij maken gebruik van menselijke donor levers die zijn afgenomen voor transplantatie en worden vervolgens toegewezen voor onderzoeksdoeleinden. Standaard lever inkoop techniek houdt in situ arteriële flush van de lever na aorta cross-klemmen in hersendode donoren (DBD) of na een circulatiestilstand in de bloedsomloop dood donoren (DCD), in meer detail elders 20 beschreven. Bovendien wordt de lever gekoeld tijdens de aanbesteding door het vullen van de buikholte van de donor met ijs. Flush oplossing voorkeuren verschillen tussen de regio&#39;s, met de meerderheid van aanbestedingen met behulp van de Universiteit van Wisconsin of histidine-tryptofaan-ketoglutarate (HTK) oplossing. Een extra back-tafel flush van de poortader verbetert de uitspoeling van de resterende bloed. Levers worden vaak aangeschaft waardoor er een aortasegment surhet afronden van de coeliakie kofferbak. De galblaas wordt ingesneden, gal wordt afgezogen en de galwegen wordt gespoeld. De levers worden verpakt in een steriele zakken met ijskoude behoud oplossing en in de aangewezen dozen of koelers vervoerd. Voor representatieve resultaten warme en koude ischemie tijd te beperken tot 60 min en 12 uur, respectievelijk. Ondanks de routinematige serologische screening voor overdraagbare ziekteverwekkers, moeten standaard voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het overhandigen van menselijke organen, monsters verkregen uit menselijke organen, en eventuele afvalproducten. Het protocol beschrijft hier subnormothermic machine perfusie met behulp van een in de handel verkrijgbaar leverperfusie apparaat. Het gebruik van een dergelijke inrichting maakt snellere vertaling naar de klinische setting en kruisvalidatie van tussen onderzoeksgroepen en transplantatiecentra verschillende protocollen en apparaatinstellingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Assist perfusion device</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Assist disposable set</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist disposable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1878&#8211;6x500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co</td>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>MGH pharmacy</td>
			<td>7750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ZO2OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty gas regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y11244D580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2324X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>316-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Adson forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debakey tissue forceps, 7.75&#8221;, 2.25 mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors 7&#34; Curved SureCut Tungsten</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6965SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle holder 5.5&#8211;7&#8221;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 blackbraided silk sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA66G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>C554D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood gas analysis machine</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidPoint 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance scale</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-10000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure display box</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pressure display sets</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>61000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td colspan="2">EW-91500-04 and EW-08516-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>30005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irrigation set flush tubing</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>06543-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing bowl, 4L</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07300-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

Een aantal observaties en analyses kunnen op de lever worden uitgevoerd tijdens perfusie, met inbegrip van directe real-time observaties, zoals debieten en gal productie; real-time metingen, zoals gas analyse van het perfusaat, en metingen post-hoc die zijn gemaakt na de monsterneming waaronder biochemische analyse van het perfusaat en weefsel en histologische analyse. De resultaten die hier genoemd zijn vanaf 22 geperfundeerde menselijke levers. Levers werden voor transplantatie om verschillende redenen, waaronder donor leeftijd, overmatig warm ischemische tijd, biopsie resultaten (steatose, ontsteking, fibrose) en om logistieke redenen afgewezen. 18 levers werden aangekocht na hartdood, en 4 na hersendood. In beide gevallen werden donoren voorbehandeld met 30.000 eenheden heparine en gespoeld in situ en op de rug tafel met UW-oplossing. Bedoel koude ischemische tijd was 531 ± 237 (SD) min en de gemiddelde warme ischemische tijd was 27 ± 10 (SD) min, gemeten vanaf de intrekking van het levensteun aan koude flush. Real time waarnemingen en metingen kunnen worden gebruikt om de lever te bepalen gedurende perfusie, terwijl metingen post hoc worden onthuld na perfusie. Real-time waarnemingen Stroom door de lever begint lager dan de doelstelling debieten als gevolg van een hogere weerstand in de koude lever. Met een druk van 3 mmHg aan het PV en 30 mmHg op de HA het doel stromen algemeen zodra de lever gebeurt is opgewarmd tot 21 &#160; ° C na 60 min van perfusie (Figuur 1A). Galstroom kan doorgaans worden waargenomen binnen 10 min perfusie en gestaag geproduceerd tijdens perfusie (Figuur 1B). Bile hoeveelheid is afhankelijk van de kwaliteit van de lever en varieert van 0,3 ml / uur / kg lever tot 18 ml / min / kg. In levers met een langere warme ischemische tijd zal galstroom neiging om afbouwen, terwijl kortere warme ischemie tijd resulteert in een stabiel of zelfs te verhogengal productie. Real-time metingen Directe en frequente meting van het perfusaat door bloed gas analyse essentieel voor zowel experimentele doeleinden alsmede het onderhouden van adequate perfusie voorwaarden, belangrijker zuurstof en pH. Opgeloste zuurstof partiële druk moet groter zijn dan 700 mmHg op de instroom van zowel de PV en HA. Uitstroom zuurstofdruk, gemeten in de vena cava, neemt in het algemeen met een langere perfusie, als gevolg van een toenemende zuurstofopname. Zuurstofopname prijs kan worden berekend zoals eerder beschreven 13 en varieerde 0,5-2,2 ml O2 / min / kg bij het ​​begin van de perfusie 2,4-9,7 ml O2 / min / kg bij t = 3 uur (figuur 1C). Een daling in pH wordt waargenomen in de eerste 30 min (figuur 1D), voornamelijk als gevolg van lactaat release in het perfusaat. Dit kan worden ondersteund door suppletie met 8,4% natrium- bicarbonate en na ongeveer 90 minuten de pH valt terug in het normale bereik. Gewoonlijk 30-50 ml van 8,4% natriumbicarbonaat vereist. Lactaatconcentratie neemt snel in de eerste 15-30 minuten, maar begint te overlijden na het eerste uur (figuur 1E). Metingen post-hoc Levertransaminasen zoals ALT kan worden gemeten in het perfusaat. In de eerste 30 minuten een grote toename van de ALT aangetroffen waarvan de uitspoeling van ALT dat tijdens ischemie (Figuur 1F) werd uitgebracht weerspiegelt. ALT bleek goed te correleren met warme ischemische tijd 13. Machine perfusie verhoogde ATP-gehalte 2,8-voudige, als gevolg van een herstel van energie-status (figuur 1G). H &amp; E histologische analyse blijkt geen extra letsel opgelopen tijdens machine perfusie (Figuur 1 H, I). Opgemerkt zij dat de biopsie regime in dit protocol voorgesteld voor research doeleinden en is niet toepasbaar voor klinische doeleinden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figuur 1:. Evaluatie van menselijke levers tijdens machine perfusie Stroming door de PV en HA tijdens SNMP (A), de productie van gal, gekwantificeerd per uur van perfusie (B), zuurstof uprate rate (ONS), berekend uit het verschil in instroom (PV + HA) en uitstroom (vena cava), onderbroken lijnen tonen partiële zuurstofdruk in de in- en uitstroom tijdens perfusie (C), pH en lactaat tijdens perfusie (D, E), afgifte van ALT in het perfusaat (F), ATP gehalte gemeten in weefsel van biopsies per uur (G) en H &amp; E vlekken van de lever (54 jaar oud DCD, 19 min warme ischemie, 559 min koude ischemie) voor (H) en na (I) perfusie. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

We beschrijven een werkwijze voor ex vivo machine perfusie van menselijke lever transplantaten bij subnormothermic temperatuur (21 ° C).

Functionele menselijke lever behoud en herstel door middel van Subnormothermic Machine perfusie

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Techniek van Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Leverperfusie voor de opslag, Assessment, en reparatie van Marginal Lever Enten

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human aderen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusie en Externe Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Geïsoleerde leverperfusie voor de behandeling van leveruitzaaiingen van oogmelanoom

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotherme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Nier Perfusie voor het Behoud van de Nier transplantaten voorafgaand aan de transplantatie

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Wijze van Direct Segmentale Intra-lever Delivery Met behulp van een Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Een kleine diermodel van Ex Vivo Normothermic lever perfusie

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

Dynamische navigatie in endodontie: begeleide voorbereiding van de toegangsholte door middel van een geminiaturiseerd navigatiesysteem

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusie voor het behoud van Pancreas allogläts vóór transplantatie

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...