Name: functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

Finansiering fra det amerikanske National Institutes of Health (bevilger R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 og F32 DK103500), CIMIT prosjekt nr 12-1732 og Shriners Hospitals for Children er takknemlig erkjent. Vi vil gjerne takke for den New England Organ Bank for å støtte dette arbeidet.

Bruken av menneskelig vev må gjennomgås av en Institutional Review Board (IRB) eller tilsvarende. Arbeidet er beskrevet her ble godkjent og erklært fritatt ved Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (No. 2011P001496). 1. Løsning Forberedelse <ol><li> Tilsett aseptisk kosttilskudd for å fenolrød fritt Williams &#39;medium E som skissert i tabell 1. Løsningen bør være forberedt frisk før bruk. Insulin bør legges like før bruk. </li></ol> 2. Tilbake Tabell Utarbeidelse av leveren <ol><li> Plassere en isfylte organ bolle på et sterilt, drapert overflate. Fjern leveren fra boksen, la den ligge i posen med kaldt bevaring løsning. Holde leveren det meste under vann. </li><li> Identifiser leverpulsåren (HA), som vil bli plassert distalt til den aortiske plasteret. Dissekere gratis arterien for å avdekke ulike greiner langs lengden hjelp Metzenbaum saks. Nøye dissect hele lengden av arterien for å hindre kutte et kar som forsyner leveren. Ikke kutt eller tie grener som ikke har en synlig slutt. </li><li> Feste alle arterielle grener ikke leverer leveren ved hjelp av silkesutur som strekker seg fra 0 til størrelse 4-0, avhengig av størrelsen av fartøyet. Nære grener som er for kort til å binde eller hull i arterien med en maske av 7-0 prolen. Slips og kutte milt og venstre mage arterier nær deres opprinnelse på cøliaki stammen. </li><li> Fjern aortic patch ved å kutte cøliaki stammen direkte under plasteret. Cannulate cøliaki stammen bruker aortic kanyle. </li><li> Identifisere portvenen (PV) og uten omsvøp dissekere det fri. Tie av eventuelle greiner og cannulate PV med forberedt segmentet av størrelse 24 rør. </li><li> Fjerne deler av membran fra suprahepatic vena cava, uten å kutte venen seg selv. Avløp fra vena cava avløp direkte inn i orgelkammeret. </li><li> Skjær to full omkrets tissue prøver (2-3 mm lengde) fra enden av den felles gallegang; snap fryse en i flytende nitrogen (lagres ved -80 ° C), og å lagre den andre i 10% bufret formalin, for vev og histologisk analyse, respektivt. Cannulate felles gallegang med fartøyet kanyle og en dreneringsslange laget av membran oxygenator slange. </li><li> Identifisere og ligate cystisk kanalen med en 0 silkeslips. Cystisk kanalen er funnet mellom den felles gallegang og galleblæren. </li><li> Koble flush slangen satt til iskalde poser med Ringer-laktat (LR) løsning og prime slangen, fjerne all luft. </li><li> Still flyt regulator på spyleslangen til en treg vedlikeholdslading. Før du kobler flush slangen til portal vene kanyle, okkluderer portvenen med fingrene på hilus og fylle kanylen og vene med flush å fjerne luft fra portalen blodåre. Ikke heve posen mer enn 20 cm over høyden av leveren under kaldspyling for å unngå for høyt trykk ivene. </li><li> Under flush kort okkludere PV på det laveste punktet. Undersøke PV for lekkasjer. Fartøyet grener kan stenges av som beskrevet ovenfor. Spyl leveren gjennom PV med totalt 2 liter iskald LR. </li><li> Gjenta trinn 2.10, 2.11 for HA med en L av LR. </li></ol> 3. Grunning SNMP System <ol><li> Prime perfusjon enhet ved tilsetning av 2 liter perfusatet (21 ° C) til organ bollen og start av anordningen for å prime slangen. Følg enhetens undervisning for å forberede for perfusjon, sette temperaturen til 21 ° C. Begynn med presset av 3 mmHg og 30 mmHg på PV og HA, henholdsvis. Åpne gasstank og innstilt på en strømningshastighet på 3 l / min. </li><li> Ta en blodgass prøve fra både HA og PV tilsig ved å tegne en 0,3 ml prøve fra prøve porter og kjører det i blodet gassanalyse maskin i henhold til produsentens instruksjoner. Bekreft tilstrekkelig oksygen (pO 2&gt; 700 mm Hg) og pH (7,35 til 7,45). </li><li> Før leveren er koblet ta en 1,0 ml prøve av perfusatet som ved = 0-måling i et Eppendorf-rør og oppbevares ved -80 ° C. Skjær to ± 250 mg kile biopsier fra leveren ved hjelp av en enkel gjennomgang stål blad; snap fryse en i flytende nitrogen (lagres ved -80 ° C), og å lagre den andre i 10% bufret formalin. Veie leveren før perfusjon. </li></ol> 4. Menneskelig leverperfusjon <ol><li> Overfør leveren til enheten. Koble PV tilsig til PV kanyle, etter fjerning luft fra PV som i trinn 2.10. Koble HA på en lignende måte. Satt PV og HA trykket til 3 og 30 mmHg. Leveren bør nesten nedsenket av perfusatet. Dekke eventuelle tørre overflater, inkludert tilsigsårene, med våt steril kompress for å unngå dehydrering </li><li> La galle rør avløp inn i en oppsamlingsbeholder. Sørge for at åpningen av galle avløpet på nivået av leveren eller lavere for å tillate galle å kjøre oUT fritt. </li><li> Target hastigheter er henholdsvis 275-325 ml / min.kg og 50-100 ml / min.kg for PV og HA når leveren har varmet til 21 ° C. Siden hver leveren reagerer forskjellig på perfusjon, overvåke flyten nøye i løpet av de første minuttene. Øke eller redusere trykket på hver av skipene dersom målet strømningsrater ikke er nådd. Ikke overstige 50 mmHg på HA og 5 mmHg på PV. </li><li> Prøvene kan tas fra leveren vev, perfusatet og galle på etterforskere preferanse. Vi anbefaler som et minimum følgende prøvetakingsregime under perfusjon. <ol><li> Vevsbiopsier, n = 2 x 250 mg, hver time. Oppbevaring: snap fryse ett i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C langsiktig. I tillegg tar en annen biopsi før og etter perfusjon og fikse i 10% bufret formalin (n = 1) </li><li> Perfusatprøver, n = 2 x 1 ml, hvert 15. minutt i den første timen, og hvert 30 min deretter. Tegn prøver fra PV inflav prøven porten. Oppbevaring: -80 ° C langsiktig. </li><li> Blodgassanalyse av PV og HA tilsig, og vena cava strøm. n = 3 x 0,3 ml, hvert 30. min. Tegn prøver fra både PV og HA sample-porter. Tegn en 0,3 ml prøve fra vena cava ved å sette en sprøyte i venen og kjøre direkte i blodet gass analysator. Bruk utgang for å sikre tilstrekkelig oksygen og pH. </li><li> Galle produksjon, n = 1 x 1 ml, hver time. Visuelt kvantifisere galle produksjon hver time og ta en prøve fra oppsamlingsbeholder. Fornye beholderen etter prøvetaking. Oppbevaring: tørris og -80 ° C langsiktig. </li></ol></li><li> Fortsett perfusjon i 3 timer. Overvåking av trykk, pH og oksygentilførsel og tar prøver hele. Juster pH han ved å tilsette natriumbikarbonat til perfusatet. </li><li> Ved slutten av perfusjonen ta de endelige prøver mens leveren blir perfusert. Koble fra leveren og fjerne gallegangen kanyle. Ta 2 post-perfusjon vevsprøver avgallegang som beskrevet tidligere for lagring ved -80 ° C og i 10% bufret formalin. </li><li> Kast den menneskelige leveren følgende riktig biohazard avhendings retningslinjer. </li></ol>

<ol>
	<li>Merion, R. M., Pelletier, S. J., Goodrich, N., Englesbe, M. J., Delmonico, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+after+cardiac+death+as+a+strategy+to+increase+deceased+donor+liver+availability.">Donation after cardiac death as a strategy to increase deceased donor liver availability.</a> Ann Surg. 244 (4), 555-562 (2006).</li><li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+machine+preservation+facilitates+successful+transplantation+of+'orphan'+extended+criteria+donor+livers.">Hypothermic machine preservation facilitates successful transplantation of 'orphan' extended criteria donor livers.</a> Am J Transplant. 15, 161-169 (2015).</li><li>Dutkowski, P., Schlegel, A., de Oliveira, M., M&#252;llhaupt, B., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOPE+for+human+liver+grafts+obtained+from+donors+after+cardiac+death.">HOPE for human liver grafts obtained from donors after cardiac death.</a> J Hepatol. 60 (4), 765-772 (2013).</li><li>Dutkowski, P., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutions+to+Shortage+of+Liver+Grafts+for+Transplantation.">Solutions to Shortage of Liver Grafts for Transplantation.</a> Br J Surg. 101 (7), 739-774 (2014).</li><li>Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+Normothermic+Liver+Perfusion:+An+Update.">Ex-vivo Normothermic Liver Perfusion: An Update.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).</li><li>Monbaliu, D., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+Perfusion+of+the+Liver:+Past,+Present,+and+Future.">Machine Perfusion of the Liver: Past, Present, and Future.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 160-166 (2010).</li><li>Matsuno, M., Uchida, K., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Machine+Perfusion+Preservation+of+Liver+Grafts+From+Donation+After+Cardiac+Death.">Impact of Machine Perfusion Preservation of Liver Grafts From Donation After Cardiac Death.</a> Transplant Proc. 46 (4), 1099-1103 (2014).</li><li>Schlegel, A., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypothermic+machine+perfusion+in+liver+transplantation.">Role of hypothermic machine perfusion in liver transplantation.</a> Transplant Int. , (2014).</li><li>Op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers.">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> Am J Transplant. 13, 1327-1335 (2013).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+prophylaxis+in+(sub)normothermic+organ+preservation:+In+vitro+efficacy+and+toxicity+of+cephalosporins.">Antibiotic prophylaxis in (sub)normothermic organ preservation: In vitro efficacy and toxicity of cephalosporins.</a> Transplantation. 95 (8), 1064-1069 (2013).</li><li>Post, I. C., Dirkes, M. C., Heger, M., Bezemer, R., van't Leven, J., van Gulik, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+flow+and+pressure+management+in+machine+perfusion+systems+for+organ+preservation.">Optimal flow and pressure management in machine perfusion systems for organ preservation.</a> Ann Biomed Eng. 40 (12), 2698-2707 (2012).</li><li>Post, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+preservation+at+hypothermic+to+normothermic+conditions+using+clinical+and+experimental+organ+preservation+solutions.">Endothelial cell preservation at hypothermic to normothermic conditions using clinical and experimental organ preservation solutions.</a> Exp Cell Res. 319 (17), 2501-2513 (2013).</li><li>Klein, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Donation+and+Utilization+in+the+United+States,+1999-2008.">Organ Donation and Utilization in the United States, 1999-2008.</a> Am J Transplant. 10 (4), 973-986 (2010).</li><li>Jay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Increased+Costs+of+Donation+After+Cardiac+Death+Liver+Transplantation.">The Increased Costs of Donation After Cardiac Death Liver Transplantation.</a> Ann Surg. 251 (4), 743-748 (2010).</li><li>Seehofer, D., Eurich, D., Veltzke-Schlieker, W., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+Complications+After+Liver+Transplantation:+Old+Problems+and+New+Challenges.">Biliary Complications After Liver Transplantation: Old Problems and New Challenges.</a> Am J Transplant. 13, 253-265 (2013).</li><li>Morrissey, P., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+After+Circulatory+Death:+Current+Practices,+Ongoing+Challenges+and+Potential+Improvement.">Donation After Circulatory Death: Current Practices, Ongoing Challenges and Potential Improvement.</a> Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).</li><li>Verdonk, R., Buis, C., Porte, R., Haagsma, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+complications+after+liver+transplantation:+A+review.">Biliary complications after liver transplantation: A review.</a> Scand J Gastroenterol. 41, 89-101 (2006).</li><li>Pine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Transplantation+Following+Donation+After+Cardiac+Death:+An+Analysis+Using+Matched+Pairs.">Liver Transplantation Following Donation After Cardiac Death: An Analysis Using Matched Pairs.</a> Liver Transpl. 15 (9), 1072-1082 (2009).</li><li>Sutton, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+for+viability+assessment+of+discarded+human+donor+livers+during+ex+vivo+normothermic+machine+perfusion.">Criteria for viability assessment of discarded human donor livers during ex vivo normothermic machine perfusion.</a> PLoS One. 11, e110642 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnormothermic+Machine+Perfusion+for+Ex+Vivo+Preservation+and+Recovery+of+the+Human+Liver+for+Transplantation.">Subnormothermic Machine Perfusion for Ex Vivo Preservation and Recovery of the Human Liver for Transplantation.</a> Am J Transplant. 14, 1400-1409 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., Yarmush, M. L., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organomatics+and+organometrics:+Novel+platforms+for+long-term+whole-organ+culture.">Organomatics and organometrics: Novel platforms for long-term whole-organ culture.</a> Technology. 02 (1), 13-22 (2014).</li><li>Berendsen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+subnormothermic+machine+perfusion+system+restores+ischemically+damaged+liver+grafts+in+a+rat+model+of+orthotopic+liver+transplantation.">A simplified subnormothermic machine perfusion system restores ischemically damaged liver grafts in a rat model of orthotopic liver transplantation.</a> Transplant Res. 1 (1), 6 (2012).</li></ol>

Drs. BE Uygun, K Uygun og Yarmush er oppfinnere på en patent som er relevant for denne studien (WO / 2011/002 926), og legene. BE Uygun, K Uygun og Yarmush er oppfinnere på en patent som er relevant for denne studien (WO / 2011/35223). Drs. K Uygun og Bruinsma har en foreløpig patentsøknad knyttet til dette arbeidet. Dr. K Uygun og BE Uygun ha en økonomisk interesse i Organ Solutions, et selskap fokusert på å utvikle organbevaring teknologi. Dr. K Uygun og BE Uygun interesser forvaltes av MGH og Partners Healthcare i samsvar med deres interessekonflikt politikk.

I et forsøk på å gjenopprette lever skadet under iskemi utviklet vi et SNMP system som kan brukes etter en periode med kald lagring. Subnormothermic maskin perfusjon tilbyr et levedyktig alternativ til konvensjonell kjølelager, samt hypotermiske og normotermisk maskin perfusjon modaliteter. Ulike systemer eksisterer; alle har ulike fordeler og ulemper 3,9,20. SNMP tillater perfusjon uten oksygenbærer, som metabolske oksygen krav på 21 ° C er oppfylt ved aktiv oksygenering av perfusatet. Selv om redusert under subnormothermic forhold, er stoffskiftet betydelig og krever støtte fra et næringsrikt perfusjon løsning. Tradisjonelle perfusjon oppløsninger, slik som Belzer maskinen perfusjon oppløsning, er generelt minimal i sammensetning og er utformet for kald perfusjon. Williams Medium E har vært brukt som en hepatocytt kulturmedium i mange år, og inneholder components som er universelle for å støtte cellular funksjon, særlig i henhold varme ex vivo forhold. Målinger ble gjort under maskinens perfusjon er representativ for den funksjon av organet. Direkte observerbare parametre som galle produksjon og oksygenopptak er virkelige tidsmålinger som kan brukes for å vurdere lever pre-transplantasjon. På samme måte kan markører for cellulær skade og iskemi (K +, laktat release) måles direkte i perfusjon løsning og kan være en indikasjon på organfunksjon 20. Som maskin perfusjon teknologien utvikler videre og oppnår mer utbredt klinisk anvendelse, kan nøyaktige korrelasjoner mellom ex vivo funksjon og klinisk resultat gjøres og perfusjon parametere vil være nyttig i å hjelpe beslutninger til transplantasjon eller avvise marginal kvalitet lever. Videre, som point-of omsorg analyseverktøy forhånd, vil mer sofistikert analyse bli tilgjengelig direkte under maskin perfusjon 21. I dette arbeidet viser vi at lever kan støttes i SNMP-system med minimal skade på leveren, reflekteres av histologi og frigjøring av ALT. Funksjonell gjenvinning av leveren er best reflektert fra ATP, som har blitt vist å korrelere til leveren levedyktighet og er sterkt tyder på transplantasjon suksess i dyremodeller 22. Ex vivo og pre-transplantasjon utvinning av levertransplantater ville tillate en betydelig utvidelse av donor leveren basseng, korrigere misforhold mellom tilbud og etterspørsel av donor lever i transplantasjon.

Levertransplantasjon er den eneste kurativ behandling for titusener av pasienter som lider av end-stage leversykdom. For å lette vellykket transplantasjonen, optimal konservering av leveren fra det tidspunkt den blir anskaffet fra donor før det tidspunkt den blir implantert i mottakeren er nødvendig for å hindre rask forverring av transplantatet. Den nåværende standard for leveren konservering er betegnet &quot;statisk kjølelager &#39;: leveren ble avkjølt på et is-kald bevaring løsning, for derved å redusere metabolismen av leveren og bremse ned de skadelige virkninger av iskemi. Selv om denne kjølelager teknikk har gjort det mulig for vellykket transplantasjon, organer av marginal kvalitet som DCD organer skadet av varm iskemi eller steatosis showet dårligere pasient utfall en. Det er en raskt voksende mengde bevis som ex vivo maskin perfusjon av lever grafts som et alternativ bevaring modalitet kan potensielt imbevise utfall for disse marginale organer 2,3. Levertransplantasjon har blitt et offer for sin egen suksess. Langt flere pasienter blir henvist for transplantasjon enn det er lever tilgjengelige, og tusenvis dø på ventelisten i USA hvert år. Gitt realiteten av donor lever mangel og den økende utnyttelse av lever grafts av suboptimal kvalitet for trengende mottakere, er det en utbredt oppfatning at ex vivo maskin perfusjon av lever grafts før implantasjon holder løftet om et paradigmeskifte i levertransplantasjon. Det har vært en markant økning i forskningsinteresse i dette emnet de siste årene 4-8. I ulike europeiske og nordamerikanske sentre hypotermisk maskin perfusjon har gjort en klinisk innføring 8 og normotermisk maskin perfusjon ved fysiologiske temperaturer har nylig blitt brukt til kasserte menneskelige lever og blir oversatt til klinisk bruk samt ni.Omfattende utvikling har ført til utvikling av ulike protokoller, mens kontinuerlig optimalisering identifiserer den optimale perfusjon parametere 10-12. Bruk av marginal kvalitet grafts har økt mer enn 10 ganger i løpet av det siste tiåret 13. Sammenlignet med dagens standard for leveren bevaring (statisk kald lagring), gir ex vivo maskin perfusjon mange potensielle fordeler, som alle fører til sårt tiltrengt utvidelse av orgelet basseng og potensielt nedgang i forekomsten av post-transplantasjons komplikasjoner. Spesielt galle komplikasjoner som for tiden plager suboptimal kvalitet levertransplantater etter transplantasjon forblir et betydelig problem 14-18. Maskin perfusjon ved subnormothermic forhold gir et tidsvindu for å vurdere organfunksjon objektivt om det er passende for transplantasjon 19. Mens leveren blir perfusert i en ex vivo-krets, både perfusatet ennd galle som produseres i løpet av perfusjon kan prøves for måling av markører for organfunksjon. På denne måten «alvorlig kompromittert &#39;lever som er forkastet for transplantasjon under de gjeldende kriterier objektivt kan vurderes i forhold til deres egnethet for transplantasjon. Levedyktighet vurdering tillater potensielt mange av disse organer til å bli utnyttet for transplantasjon. En like kraftig fordel av maskin perfusjon er reparasjon og forbedring av lever som har blitt skadet av varm / kald iskemi. ATP er oppbrukt meget hurtig under varme og påfølgende kald ischemi og kan repleted i løpet av en periode på maskin perfusjon før implantering av leveren 20. Leveren, med sine energi butikker og metabolske tilstand etterfylles, er preconditioned og bedre forberedt for de skadelige effektene av reperfusjonsskade etter implantasjon i resipienten. Dette arbeid beskriver en fremgangsmåte for ex vivo maskin perfusjon av human lever grafts i laboratoriet, som vil være nyttig for forskere som ønsker å studere både teknikk og gunstige effektene av ex vivo maskin perfusjon. Vi gjør bruk av menneskelige donor lever som har blitt avvist for transplantasjon og deretter avsatt til forskningsformål. Standard leveren anskaffelse teknikk involverer in situ arteriell innfelt i leveren etter aorta kryssklem i hjernedød donorer (DBD) eller etter sirkulasjons arrest i sirkulasjonsdøds donorer (DCD), beskrevet i mer detalj et annet sted 20. I tillegg er leveren avkjølt under anskaffelses ved å fylle donor bukhulen med is. Flush løsning preferanser varierer mellom regioner, med de fleste av anskaffelser ved hjelp av University of Wisconsin eller Histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) løsning. En ekstra back-tabellen flush av portalen blodåre forbedrer utvasking av blodrester. Lever ofte anskaffet forlater en aortic segment suravrunding cøliaki stammen. Galleblæren er radert, galle er aspirert, og galle duct spyles. Leveren er pakket i sterile poser som inneholder iskald bevaring løsning og transporteres i utpekte bokser eller kjølere. For representative resultater varm og kald ischemi tiden bør være begrenset til 60 minutter og 12 timer, henholdsvis. Til tross for rutine serologisk screening for smittsomme patogener, må vanlige forholdsregler tas når levere menneskelige organer, eksempler hentet fra menneskelige organer, og eventuelle avfallsprodukter. Protokollen her beskriver subnormothermic maskin perfusjon med en kommersielt tilgjengelig leverperfusjon enhet. Bruk av en slik enhet sørger for raskere oversettelse til klinisk setting og kryss-validering av ulike protokoller og enhetsinnstillinger blant forskningsmiljøer og transplantasjonssentre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Assist perfusion device</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Assist disposable set</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist disposable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1878&#8211;6x500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co</td>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>MGH pharmacy</td>
			<td>7750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ZO2OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty gas regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y11244D580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2324X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>316-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Adson forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debakey tissue forceps, 7.75&#8221;, 2.25 mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors 7&#34; Curved SureCut Tungsten</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6965SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle holder 5.5&#8211;7&#8221;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 blackbraided silk sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA66G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>C554D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood gas analysis machine</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidPoint 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance scale</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-10000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure display box</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pressure display sets</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>61000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td colspan="2">EW-91500-04 and EW-08516-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>30005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irrigation set flush tubing</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>06543-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing bowl, 4L</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07300-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

En rekke observasjoner og analyser kan utføres på leveren under perfusjonen, inklusive direkte sanntidsmålinger, slik som strømningshastigheter og galle produksjon; virkelige tidsmålinger, slik som gassanalyse av perfusatet, og post-hoc-målinger som er foretatt etter prøvetakingen inkludert biokjemisk analyse av perfusatet og vev og histologisk analyse. Resultater som er nevnt her er fra 22 perfundert menneskelige lever. Livers ble avvist for transplantasjon av ulike grunner, inkludert donor alder, overdreven varme iskemisk tid, biopsi resultater (steatose, betennelse, fibrose) og for logistiske årsaker. 18 lever ble anskaffet etter hjertedød, og 4 etter hjerne død. I begge tilfeller ble givere forbehandlet med 30 000 enheter av heparin og spyles in situ og på baksiden bord med UW-løsning. Mener kalde iskemisk tid var 531 ± 237 (SD) min, og gjennomsnittlig varm iskemisk tid var 27 ± 10 (SD) min, målt fra tilbaketrekking av livetstøtte til kaldt flush. Sanntid observasjoner og målinger kan brukes til å vurdere leveren under perfusjonen, mens post-hoc-målinger er avdekket etter perfusjon. Sanntidsobservasjoner Strømning gjennom leveren begynner lavere enn målet strømningshastigheter, som et resultat av en høyere motstand i kald leveren. Ved hjelp av et trykk på 3 mm Hg for PV og 30 mmHg i HA målet strømmer kan generelt bli oppnådd når leveren er varmet opp til 21 &#160; ° C etter 60 min perfusjon (figur 1A). Galle flyte kan vanligvis observeres innen 10 minutter av perfusjon og er produsert jevnt under perfusjon (figur 1B). Bile mengde avhenger av kvaliteten av leveren, og i området fra 0,3 ml / time / kg leveren til 18 ml / min / kg. I lever med lengre varm iskemisk tid, vil galle flyte tendens til å avta, mens kortere varme iskemiske tid resulterer i en mer stabil eller økendegalle produksjon. Sanntidsmålinger Direkte og hyppig måling av perfusatet av blodgassanalyse i avgjørende for både eksperimentelle formål, samt opprettholde tilstrekkelig perfusjon forhold, viktigere oksygenering og pH. Oppløst oksygen-partialtrykk bør være større enn 700 mmHg for tilførsel av både PV og HA. Avløp oksygentrykket, målt i vena cava, vanligvis avtar med lengre perfusjon, noe som reflekterer en økende oksygenopptak. Oksygenopptak priser kan beregnes som beskrevet tidligere 13 og varierte 0,5 til 2,2 ml O 2 / min / kg i begynnelsen av perfusjon til 2.4 til 9.7 ml O 2 / min / kg ved t = 3 timer (figur 1C). En dråpe i pH er observert i de første 30 min (figur 1D), primært som følge av laktat utgivelse i perfusatet. Dette kan støttes av tilskudd med 8,4% natrium bicarboNate og etter ca 90 min pH faller tilbake i normalområdet. Vanligvis 30-50 ml av 8,4% natriumbikarbonat er nødvendig. Laktatkonsentrasjonen øker raskt i første 15-30 min, men begynner å decease etter den første timen (figur 1E). Post-hoc-målinger Levertransaminaser som ALT kan bli målt i perfusatet. I de første 30 min en stor økning av ALT er vanligvis observert som reflekterer utvasking av ALT som ble utgitt under iskemi (figur 1F). ALT er vist å korrelere godt med varmt iskemisk tid 13. Maskin perfusjon økte ATP innhold 2.8 ganger, noe som reflekterer en recovery energistatus (figur 1G). H &amp; E histologisk analyse avslører ingen ytterligere skade påført under maskin perfusjon (figur 1 H, I). Det bør bemerkes at biopsi regime foreslått i denne protokollen er for research formål og kan ikke være aktuelt for kliniske formål. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figur 1:. Vurdering av menneskelige lever under maskin perfusjon Flow gjennom PV og HA i løpet av SNMP (A), galle produksjon, kvantifisert per time av perfusjon (B), oksygen uprate rate (VÅR), beregnet ut fra forskjellen i tilsig (PV + HA) og strøm (vena cava), avbrutt linjene viser delvis oksygentrykket i inn- og utstrømming under perfusjon (C), pH og laktat under perfusjon (D, E), frigjøring av ALT inn perfusatet (F), ATP innhold målt i vev fra time biopsier (G) og H &amp; E flekker av leveren (54 år gammel DCD, 19 min varm ischemi, 559 min kald ischemi) før (H) og etter (I) perfusjon. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Vi beskriver en fremgangsmåte for ex vivo maskin perfusjon av humane levertransplantater ved subnormothermic temperatur (21 ° C).

Funksjonell Menneskelig Liver Bevaring og gjenoppretting ved hjelp av Subnormothermic Machine Perfusjons

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique av Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Leverperfusjon for bagasje, Assessment, og reparasjon av begrensede lever grafts

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Prosedyre for menneske saphena Veins<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusjons og ekstern forsterkning

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolert Lever Perfusjons som en behandling for levermetastaser av Uveal Melanom

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Nyre Perfusjons for Bevaring av Kidney grafts før Transplantasjon

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering av en humanisert muselever med humane lever stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Metode for direkte Segmental Intra-lever Levering Ved hjelp av en rottelever hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En liten dyr modell av Ex Vivo Normothermic lever perfusjon

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

Dynamisk navigasjon i endodonti: Klargjøring av tilgangshulrom ved hjelp av et miniatyrisert navigasjonssystem

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic Ex vivo Pancreas Perfusion for bevaring av bukspyttkjertelen allotransplantater før transplantasjon

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...