Name: functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

Финансирование из американского Национального института здоровья (гранты R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 и F32 DK103500), CIMIT проект № 12-1732 и Шрайнерс больницы для детей с благодарностью. Мы хотели бы с благодарностью признать Новой Англии Банк Органный за поддержку этой работы.

Использование человеческой ткани должны быть рассмотрены институциональной наблюдательный совет (IRB) или его эквивалент. Работа, описанная здесь был одобрен и объявил освобождаются от Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (No. 2011P001496). 1. Решение Подготовка <ol><li> Соблюдая правила асептики, добавьте дополнения к фенолового красного Уильямса среды Е, как указано в таблице 1. Раствор следует готовить свежий перед использованием. Инсулин должен быть добавлен непосредственно перед использованием. </li></ol> 2. Вернуться Таблица Подготовка печени <ol><li> Разместить органов миску льда заполняется на стерильной, драпированные поверхности. Удалить печень от коробки, оставив его в сумке холодной консервирующим раствором. Держите печени в основном под водой. </li><li> Определение печеночной артерии (га), который будет расположен дистально по отношению к аорты пластыря. Проанализируйте бесплатно артерию, чтобы показать различные резали ветви по длине с помощью Metzenbaum ножницы. Тщательно ДиссеКТ по ​​всей длине артерии, чтобы предотвратить разрыва сосуда, который подает печень. Ничего не вырезано и не связывайте филиалов, которые не имеют видимого конца. </li><li> Tie от всех артериальных ветвей не поставляет печень с помощью шелковой нити в диапазоне от 0 до размера 4-0, в зависимости от размера судна. Закрыть подразделений, которые являются слишком коротка, чтобы связать или отверстия в артерии с стежка 7-0 проленовой. Наконечник и сократить селезенки и левой желудочной артерии, близкие к их происхождения на чревного ствола. </li><li> Удалить аорты патч путем разрезания чревного ствола непосредственно под патч. Иглу чревного ствола с помощью аорты канюли. </li><li> Определить воротной вены (PV) и прямо рассекают его бесплатно. Свяжите от любых ветвей и иглу клипом с подготовленным сегменте размер 24 труб. </li><li> Удалить разделы диафрагмы от suprahepatic полой вены, не сокращая саму вену. Отток из полой вены стоков непосредственно в камеру органов. </li><li> Вырезать 2 полный обхват TiСГУП образцы (2-3 мм длиной) с конца общего желчного протока; оснастки заморозить один в жидком азоте (хранить при температуре -80 ° С) и хранить друга в 10% забуференном формалине, для ткани и гистологического анализа, соответственно. Иглу общего желчного протока с канюли сосудов и дренажную трубку из мембраны оксигенатора труб. </li><li> Выявление и перевязывать пузырный проток с 0 шелковый галстук. Пузырный проток находится между общего желчного протока и желчного пузыря. </li><li> Подключите флеш-трубки установлен в ледяной мешки решения Рингер-лактата (LR) и премьер-трубки, удаляя весь воздух. </li><li> Установите регулятор расхода на флеш труб в ручеек. Перед подключением флеш трубку к воротной вены катетер, закрывают в портальную вену пальцами на воротах и ​​заполнить канюли и вены с флеш для удаления воздуха из воротной вены. Не поднять мешок более чем 20 см по высоте печени во время холодной промывки, чтобы избежать чрезмерного давления навены. </li><li> Во время промывки кратко закупоривать PV в самой нижней точке. Проверьте клип на герметичность. Судно ветви могут быть закрыты, как описано выше. Промойте печень через ФЭ в общей сложности 2 л ледяной ЛР. </li><li> Повторите шаги 2,10, 2,11 для ГА-1 L ЛР. </li></ol> 3. Грунтовка SNMP System <ol><li> Председатель перфузии устройства путем добавления 2 л перфузата (21 ° C) в шаре органов и запуска устройства с простой трубки. Последующие инструкции устройства, чтобы подготовиться к перфузии, установки температуры до 21 ° С. Начните с давлением 3 мм рт.ст. и 30 мм рт.ст. на PV и га соответственно. Открыть газовый баллон и установлен в потоке 3 л / мин. </li><li> Возьмите кровь газа как из ГК и PV притока рисуя 0,3 мл образца от образца портов и запустить его в анализе машины газов крови в соответствии с инструкциями изготовителя. Подтвердите адекватной оксигенации (PO 2&gt; 700 мм рт.ст.) и рН (7,35-7,45). </li><li> Перед печени подключен принять 1,0 мл образца перфузат как у = 0 измерений в пробирке Эппендорфа и хранить при -80 ° С. Вырежьте два ± 250 мг клин биопсии из печени с помощью однолезвийным стальным лезвием; оснастки заморозить один в жидком азоте (хранить при температуре -80 ° С) и хранить друга в 10% забуференном формалине. Взвесьте печень до перфузии. </li></ol> 4. печени человека перфузии <ol><li> Передача печени устройства. Подключите приток PV в PV канюли, после удаления воздуха из PV, как в шаге 2.10. Подключите HA аналогичным образом. Установите PV и HA давление 3 и 30 мм рт. Печень должна быть почти затоплен перфузат. Закрывайте сухие поверхности, в том числе притока сосудов, с мокрым стерильной марли, чтобы предотвратить обезвоживание </li><li> Пусть утечки желчи труб в сборный контейнер. Убедитесь, что открытие в канализацию желчи на уровне печени или ниже, чтобы желчь для запуска Oут свободно. </li><li> Ставки целевого потока являются 275-325 мл / min.kg и 50-100 мл / min.kg для PV и HA соответственно один раз печень нагревают до 21 ° С. Так как каждый печени по-разному реагирует перфузии, контроль потока внимательно в течение первых минут. Увеличение или уменьшение давления на одном из судов, если темпы целевого потока не достигнуто. Не превышайте 50 мм рт.ст. на га и 5 мм рт.ст. на PV. </li><li> Образцы могут быть взяты из ткани печени, перфузат и желчи в предпочтении исследователей. Мы рекомендуем как минимум следующий пример схемы сбора при перфузии. <ol><li> Биопсия тканей, N = 2 х 250 мг каждый час. Хранение: оснастки заморозить один в жидком азоте и хранят при -80 ° C в долгосрочной перспективе. Кроме того, взять другую биопсию до и после перфузии и зафиксировать в 10% формалине с буфером (п = 1) </li><li> Образцы перфузата, п = 2x 1 мл, каждые 15 мин в течение первого часа и каждые 30 мин после этого. Нарисуйте образцы из PV инфнизкий порт образец. Хранение: -80 ° C в долгосрочной перспективе. </li><li> Анализ газов крови ФВ и притока га, а полой вены оттока. N = 3 х 0,3 мл, каждые 30 мин. Нарисуйте образцы как с PV и образцы портов га. Рисовать 0,3 мл образца из полой вены, вставив шприц в вену и непосредственно работать в газоанализатора крови. Используйте выход для обеспечения адекватной оксигенации и рН. </li><li> Производство желчи, N = 1 х 1 мл, каждый час. Визуально количественно производство желчи каждый час и взять пробу из контейнера сбора. Обновить контейнер после отбора проб. Хранение: в сухом льду и -80 ° C в долгосрочной перспективе. </li></ol></li><li> Продолжить перфузии в течение 3 ч. Мониторинг давления, рН и оксигенации и отбора проб во всем. Отрегулируйте он рН путем добавления бикарбоната натрия в перфузат. </li><li> В конце перфузии принять окончательные образцы в то время как печень быть перфузии. Отключите печень и удалить желчный проток канюли. Возьмите 2 образцов после перфузии тканей изжелчных протоков, как описано выше для хранения при -80 ° C и 10% забуференном формалине. </li><li> Откажитесь от нарушения функции печени следующие рекомендации Правильная утилизация биологически опасных. </li></ol>

<ol>
	<li>Merion, R. M., Pelletier, S. J., Goodrich, N., Englesbe, M. J., Delmonico, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+after+cardiac+death+as+a+strategy+to+increase+deceased+donor+liver+availability.">Donation after cardiac death as a strategy to increase deceased donor liver availability.</a> Ann Surg. 244 (4), 555-562 (2006).</li><li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+machine+preservation+facilitates+successful+transplantation+of+'orphan'+extended+criteria+donor+livers.">Hypothermic machine preservation facilitates successful transplantation of 'orphan' extended criteria donor livers.</a> Am J Transplant. 15, 161-169 (2015).</li><li>Dutkowski, P., Schlegel, A., de Oliveira, M., M&#252;llhaupt, B., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOPE+for+human+liver+grafts+obtained+from+donors+after+cardiac+death.">HOPE for human liver grafts obtained from donors after cardiac death.</a> J Hepatol. 60 (4), 765-772 (2013).</li><li>Dutkowski, P., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutions+to+Shortage+of+Liver+Grafts+for+Transplantation.">Solutions to Shortage of Liver Grafts for Transplantation.</a> Br J Surg. 101 (7), 739-774 (2014).</li><li>Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+Normothermic+Liver+Perfusion:+An+Update.">Ex-vivo Normothermic Liver Perfusion: An Update.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).</li><li>Monbaliu, D., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+Perfusion+of+the+Liver:+Past,+Present,+and+Future.">Machine Perfusion of the Liver: Past, Present, and Future.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 160-166 (2010).</li><li>Matsuno, M., Uchida, K., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Machine+Perfusion+Preservation+of+Liver+Grafts+From+Donation+After+Cardiac+Death.">Impact of Machine Perfusion Preservation of Liver Grafts From Donation After Cardiac Death.</a> Transplant Proc. 46 (4), 1099-1103 (2014).</li><li>Schlegel, A., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypothermic+machine+perfusion+in+liver+transplantation.">Role of hypothermic machine perfusion in liver transplantation.</a> Transplant Int. , (2014).</li><li>Op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers.">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> Am J Transplant. 13, 1327-1335 (2013).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+prophylaxis+in+(sub)normothermic+organ+preservation:+In+vitro+efficacy+and+toxicity+of+cephalosporins.">Antibiotic prophylaxis in (sub)normothermic organ preservation: In vitro efficacy and toxicity of cephalosporins.</a> Transplantation. 95 (8), 1064-1069 (2013).</li><li>Post, I. C., Dirkes, M. C., Heger, M., Bezemer, R., van't Leven, J., van Gulik, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+flow+and+pressure+management+in+machine+perfusion+systems+for+organ+preservation.">Optimal flow and pressure management in machine perfusion systems for organ preservation.</a> Ann Biomed Eng. 40 (12), 2698-2707 (2012).</li><li>Post, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+preservation+at+hypothermic+to+normothermic+conditions+using+clinical+and+experimental+organ+preservation+solutions.">Endothelial cell preservation at hypothermic to normothermic conditions using clinical and experimental organ preservation solutions.</a> Exp Cell Res. 319 (17), 2501-2513 (2013).</li><li>Klein, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Donation+and+Utilization+in+the+United+States,+1999-2008.">Organ Donation and Utilization in the United States, 1999-2008.</a> Am J Transplant. 10 (4), 973-986 (2010).</li><li>Jay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Increased+Costs+of+Donation+After+Cardiac+Death+Liver+Transplantation.">The Increased Costs of Donation After Cardiac Death Liver Transplantation.</a> Ann Surg. 251 (4), 743-748 (2010).</li><li>Seehofer, D., Eurich, D., Veltzke-Schlieker, W., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+Complications+After+Liver+Transplantation:+Old+Problems+and+New+Challenges.">Biliary Complications After Liver Transplantation: Old Problems and New Challenges.</a> Am J Transplant. 13, 253-265 (2013).</li><li>Morrissey, P., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+After+Circulatory+Death:+Current+Practices,+Ongoing+Challenges+and+Potential+Improvement.">Donation After Circulatory Death: Current Practices, Ongoing Challenges and Potential Improvement.</a> Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).</li><li>Verdonk, R., Buis, C., Porte, R., Haagsma, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+complications+after+liver+transplantation:+A+review.">Biliary complications after liver transplantation: A review.</a> Scand J Gastroenterol. 41, 89-101 (2006).</li><li>Pine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Transplantation+Following+Donation+After+Cardiac+Death:+An+Analysis+Using+Matched+Pairs.">Liver Transplantation Following Donation After Cardiac Death: An Analysis Using Matched Pairs.</a> Liver Transpl. 15 (9), 1072-1082 (2009).</li><li>Sutton, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+for+viability+assessment+of+discarded+human+donor+livers+during+ex+vivo+normothermic+machine+perfusion.">Criteria for viability assessment of discarded human donor livers during ex vivo normothermic machine perfusion.</a> PLoS One. 11, e110642 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnormothermic+Machine+Perfusion+for+Ex+Vivo+Preservation+and+Recovery+of+the+Human+Liver+for+Transplantation.">Subnormothermic Machine Perfusion for Ex Vivo Preservation and Recovery of the Human Liver for Transplantation.</a> Am J Transplant. 14, 1400-1409 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., Yarmush, M. L., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organomatics+and+organometrics:+Novel+platforms+for+long-term+whole-organ+culture.">Organomatics and organometrics: Novel platforms for long-term whole-organ culture.</a> Technology. 02 (1), 13-22 (2014).</li><li>Berendsen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+subnormothermic+machine+perfusion+system+restores+ischemically+damaged+liver+grafts+in+a+rat+model+of+orthotopic+liver+transplantation.">A simplified subnormothermic machine perfusion system restores ischemically damaged liver grafts in a rat model of orthotopic liver transplantation.</a> Transplant Res. 1 (1), 6 (2012).</li></ol>

DRS. БЫТЬ Uygun, K Uygun и Yarmush изобретатели на ожидании патента, который имеет отношение к данной работе (WO / 2011/002926), и д-ра. БЫТЬ Uygun, K Uygun и Yarmush изобретатели на ожидании патента, который имеет отношение к этой работе (WO / 2011/35223). DRS. К Uygun и Bruinsma есть предварительную заявку на патент, связанный с этой работой. Доктор K Uygun и BE Uygun иметь финансовую заинтересованность в решениях органа, компания сосредоточена на разработке сохранение орган технологий. Доктор K Uygun и БЫТЬ интересы UYGUN осуществляется управление по MGH и партнеры здравоохранения в соответствии с их конфликта интересов политики.

В попытке восстановить поврежденные печени при ишемии, мы разработали систему SNMP, что могут быть использованы после периода хранения в холодильнике. Subnormothermic машина перфузии предлагает жизнеспособную альтернативу традиционным холодного хранения, а также в условиях гипотермии и нормотермических условиях машина перфузии. Существуют различные различные системы; все предлагают различные преимущества и недостатки 3,9,20. SNMP позволяет перфузии без носителя кислорода, как метаболические потребности кислорода на 21 ° С, то при активном оксигенации перфузата. Не смотря на сниженный под subnormothermic условиях, метаболизм является существенным, и требует поддержки питательной решения перфузии. Традиционные решения перфузии, такие как машина перфузии раствором Belzer, как правило, минимальна в композиции и предназначены для холодной перфузии. Уильямса Средний Е была использована в качестве культуральной среде гепатоцитов в течение многих лет, и содержит Components, которые являются универсальными для поддержки клеточной функции, в частности, под теплыми бывших естественных условиях. Измерения, проведенные при машинной перфузии отражают функции органа. Непосредственно наблюдаемые параметры, такие как производство желчи и потребления кислорода являются измерения в реальном времени, которые могут быть использованы для оценки печени до трансплантации. Кроме того, маркеры клеточного повреждения и ишемии (К +, лактат выпуска) может быть измерена непосредственно в перфузии раствором и может свидетельствовать о функции органа 20. Как машина перфузии технология развивается дальше и достигает более широкого клинического применения, точные корреляции между экс естественных условиях функционирования и клинического исхода можно сделать и параметры перфузии будет полезен в помощи решения для пересадки или отклонить низкого качества печень. Кроме того, как точка-санитарной помощи аналитических инструментов заранее, более сложный анализ станут доступны непосредственно во время работы машин perfuСион 21. В этой работе мы показываем, что печень может поддерживаться в системе SNMP с минимальным повреждением печени, отражается гистологии и выпуска ALT. Функциональное восстановление печени лучше всего отражается АТФ, которая коррелирует с жизнеспособностью печени и убедительно указывают на успех трансплантации на животных моделях 22. Экс естественных и восстановление перед пересадкой черенков печени позволит значительное расширение донора бассейн печени, коррекции несоответствие между спросом и предложением доноров печени в трансплантации.

Трансплантация печени является единственным лечебным средством для лечения десятки тысяч пациентов, которые страдают от терминальной стадии заболевания печени. Для облегчения успешной трансплантации, оптимальное сохранение печени с момента его закупается у донора до времени, пока не будет имплантирован в получателю необходимо, чтобы предотвратить быстрое ухудшение трансплантата. Текущий стандарт для сохранения печени называется &quot;статическая холодного хранения»: печень охлаждают в консервирующим раствором ледяной, тем самым снижая метаболизм печени и замедление вредные эффекты ишемии. Хотя этот метод холодного хранения позволило к успешной пересадке, органы предельной качества, такие как DCD органов, поврежденных тепловой ишемии или стеатоз шоу нижней пациента результатов 1. Существует быстро расширяется доказательств того, что экс естественных машина перфузии шунтов печени в качестве альтернативного сохранения воздействие может потенциально имдоказать результатов для этих маргинальных органов 2,3. Трансплантация печени стала жертвой своего собственного успеха. Гораздо больше больных направляют для трансплантации, чем есть печень наличии, и тысячи умирают в списке ожидания в Соединенных Штатах каждый год. Учитывая реальность нехватки доноров печени и увеличивая использование трансплантатов печени наилучшего качества для нуждающихся получателей, он широко постановил, что экс естественных машина перфузии шунтов печени до имплантации обещает парадигмы в трансплантации печени. Там был отмечен рост научного интереса к этой теме в последние годы 4-8. В различных европейских и североамериканских центров гипотермия машина перфузии сделал клиническое внедрение 8 и нормотермических машина перфузии при физиологических температурах недавно были применены к выброшенных печени человека и переводится с использованием в клинической а также 9.Широкое развитие привело к развитию различных протоколов, непрерывная оптимизация определяет параметры оптимальной перфузии 10-12. Использование низкого качества трансплантатов возросла более чем в 10 раз за последнее десятилетие 13. По сравнению с текущим стандартом для сохранения печени (статический холод хранения), экс естественных машина перфузии предоставляет многочисленные потенциальные выгоды, все из которых приводят к столь необходимой расширения пула органов и потенциально снижение заболеваемости после трансплантации осложнений. В частности, желчных осложнений, которые в настоящее время чума неоптимальным качества трансплантатов печени после трансплантации остается существенный вопрос 14-18. Машина перфузии в subnormothermic условиях обеспечивает временное окно для оценки функции трансплантата объективно пригодности для трансплантации 19. В то время как печень время перфузии в Экс Vivo цепи, как Перфузатй желчь производится в течение перфузии можно попробовать для измерения маркеров функции органа. Таким образом, &quot;сильно скомпрометированы&quot; печень, сброшенные для трансплантации в соответствии с действующими критериями могут быть объективно оценены в отношении их пригодности для трансплантации. Оценка жизнеспособности потенциально позволяет для многих из этих органов, которые будут использоваться для трансплантации. В равной степени мощным преимуществом машины перфузии является ремонт и улучшение печени, которые были повреждены теплой / холодной ишемии. АТФ обедненного очень быстро во время прогрева и последующей холодной ишемии и может быть repleted в течение периода машины перфузии до имплантации печени 20. Печени, с его энергетических запасов и метаболического состояния пополняется, обуславливается и лучше подготовиться к вредных эффектов реперфузионного повреждения после имплантации у реципиента. Эта работа описывает способ Экс Vivo машины перфузии человека графа печениTS в лаборатории, которая будет полезна для исследователей, которые хотят изучить как технику и благотворное влияние Экс Vivo машины перфузии. Мы используем печени доноров человека, были отклонены для трансплантации, а затем, выделенных для исследовательских целей. Стандартный метод закупок печени включает в себя на месте артериальной флеш печени следующем пережатия аорты в мозг мертв доноров (DBD), или после остановки кровообращения в сосудистой доноров смерти (DCD), описанный более подробно в другом месте 20. Кроме того, печень охлаждается во время закупок путем заполнения брюшной полости донора со льдом. Флеш предпочтения решение отличаться в разных регионах, при этом большинство закупок с использованием Университет Висконсина или гистидин-триптофан-КГ (НТК) решения. Дополнительные резервные таблицы флеш воротной вены улучшает вымывание остатков крови. Печень часто закупаемых оставляя аорты сегмента сюрокругления чревного ствола. Желчного пузыря разрезают, желчь всасывается и желчных протоков очищается. Печень упакованы в стерильные пакеты, содержащие охлажденному льдом раствору сохранение и транспортируют в специально отведенных коробки или охладителей. Для репрезентативные результаты теплый и холодный время ишемии должно быть ограничено 60 мин и 12 ч, соответственно. Несмотря на обычной серологического обследования на предмет передаваемых патогенов, стандартные меры предосторожности должны быть приняты при передаче человеческих органов, образцов, полученных из человеческих органов, а также любые отходы. Протокол здесь описаны subnormothermic машины перфузии с использованием коммерчески доступного перфузии печени устройства. Использование такого устройства позволяет для более быстрого перевода в клинических условиях и перекрестной проверки различных протоколов и настроек устройства среди исследовательских групп и центров трансплантации.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Assist perfusion device</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Assist disposable set</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist disposable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1878&#8211;6x500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co</td>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>MGH pharmacy</td>
			<td>7750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ZO2OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty gas regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y11244D580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2324X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>316-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Adson forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debakey tissue forceps, 7.75&#8221;, 2.25 mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors 7&#34; Curved SureCut Tungsten</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6965SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle holder 5.5&#8211;7&#8221;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 blackbraided silk sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA66G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>C554D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood gas analysis machine</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidPoint 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance scale</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-10000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure display box</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pressure display sets</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>61000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td colspan="2">EW-91500-04 and EW-08516-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>30005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irrigation set flush tubing</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>06543-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing bowl, 4L</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07300-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

Количество наблюдений и анализов могут быть выполнены на печень при перфузии, в том числе прямых наблюдений в режиме реального времени, таких как скорости потока и производства желчи; Измерения в реальном времени, например, газового анализа перфузата и измерений после специальных, которые сделаны после сбора проб в том числе биохимического анализа перфузата и ткани и гистологического анализа. Результаты, упомянутые здесь, от 22 перфузируемые печени человека. Печень были отклонены для трансплантации по различным причинам, в том числе доноров в возрасте, чрезмерное теплой ишемии, результаты биопсии (стеатоз, воспаление, фиброз) и по техническим причинам. 18 печень были закуплены следующие сердечной смерти, и 4 после смерти мозга. В обоих случаях, доноры предварительно обрабатывали 30000 единиц гепарина и продувают в точке и на задней стол с раствором UW. Средняя холодной ишемии было 531 ± 237 (SD) мин и среднее теплый ишемическая раз был 27 ± 10 (SD) мин, считая от вывода жизниподдержка холодной флеш. Реальные наблюдения и измерения времени могут быть использованы для оценки печень во время перфузии, в то время как измерения после специальных выявлены после перфузии. В режиме реального времени наблюдения Поток через печень начинается ниже, чем ставки целевой потока, в результате более высокой устойчивостью в холодной печени. Использование давление 3 мм рт.ст. на PV и 30 мм рт.ст. на HA целевые потоки в общем случае может быть достигнуто, как только печень нагрелась до 21 &#160; ° C после 60 мин перфузии (фиг.1А). Желчи в общем случае может наблюдаться в течение 10 мин перфузии и производится непрерывно в течение перфузии (Фиг.1В). Количество желчи зависит от качества печени и составляет от 0,3 мл / ч / кг печени в 18 мл / мин / кг. В печени с длинной теплой ишемии, желчи будет, как правило, сходят, в то время как более короткие теплые ишемические времени приводит к более устойчивым или даже увеличениипроизводство желчи. Измерения в реальном времени Прямые и частые измерения перфузата путем анализа газов крови в важное значение для обеих экспериментальных целях, а также поддержание надлежащих условий для перфузии, главное оксигенации и рН. Растворенный парциальное давление кислорода должно быть больше, чем 700 мм рт.ст. на приток как PV и HA. Отток давление кислорода, измеренная в полой вены, как правило, уменьшается с более перфузии, отражает большее поглощение кислорода. Кислородные показатели поглощения может быть рассчитана, как описано выше 13 и варьировались от 0,5-2,2 мл O 2 / мин / кг в начале перфузии с 2.4-9.7 мл O 2 / мин / кг при Т = 3 ч (фиг 1С). Падение рН наблюдается в первые 30 мин (рис 1D), в первую очередь в результате лактата выпуска в перфузат. Это может быть поддержана добавок с 8,4% bicarbo натрияНейт и примерно через 90 мин рН падает обратно в пределах нормы. Как правило, 30-50 мл 8,4% раствора бикарбоната натрия требуется. Лактата увеличивается концентрация быстро в первой 15-30 мин, но начинает смертельные после первого часа (фиг 1E). Измерения ретроспективном Печеночных трансаминаз, такие как ALT может быть измерена в перфузата. В первые 30 мин значительное увеличение АЛТ, как правило, наблюдается который отражает вымывание ALT, который был выпущен во время ишемии (рис 1F). ALT было показано, что хорошо коррелирует с теплой ишемии 13. Машина перфузии увеличился содержание АТФ в 2,8 раза, что свидетельствует о энергетический статус восстановления (рис 1G). H &amp; E гистологический анализ не выявил каких-либо дополнительных травм, полученных во время машинного перфузии (рис 1H, I). Следует отметить, что схема биопсии, предложенный в этом протоколе для РЭСнить поиск целей и не могут быть применимы в клинических целях. <img alt="Фигура 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Оценка печени человека во время работы машин перфузии Поток через PV и HA во SNMP (А), производство желчи, количественно в час перфузии (В), частота завышают кислорода (OUR), рассчитывается как разность притока (PV + HA) и отток (кава), прерывистыми линиями показывают парциальное давление кислорода в стационарной и оттока во время перфузии (C), рН и лактата во время перфузии (D, E), выпуск ALT в перфузат (F), АТФ Содержание измеряется в ткани из почасовых биопсии (G) и Н &amp; Е пятен печени (54-летний DCD, 19 мин теплой ишемии, 559 мин холодовой ишемии) до (Н) и после (I) перфузии. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM. <aHREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; TARGET = &quot;_ пустое&quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Мы опишем метод экс естественных машины перфузии шунтов печени человека в subnormothermic температуре (21 ° C).

Функциональная печени человека Сохранение и восстановление с помощью Subnormothermic машины перфузии

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Методика Subnormothermic<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Печень перфузии для хранения, оценки и Ремонт окраинных печени трансплантатов

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Порядок человека подкожных вен<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Перфузии и внешнего подкрепления

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Изолированные печени перфузии для лечения метастазов в печени сосудистой меланомы

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Экс Ситу нормотермических машина перфузии Печени доноров

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Нормотермических<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Почки перфузии по охране почки графты до трансплантации

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Генерация гуманизированное печени мышей с помощью печени человека стволовые клетки

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Метод прямых Сегментные Intra-печеночной доставка с помощью модели печени крысы Hilar зажима

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Мелких животных модель Ex Vivo нормотермических печени перфузии

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

Динамическая навигация в эндодонтии: подготовка полости управляемого доступа с помощью миниатюрной навигационной системы

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Нормотермическая перфузия поджелудочной железы ex vivo для сохранения аллотрансплантатов поджелудочной железы перед трансплантацией

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...