Name: functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

Finansiering från amerikanska National Institutes of Health (beviljar R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 och F32 DK103500), CIMIT Projekt nr 12-1732 och Shriners sjukhus för barn är tack erkänt. Vi vill tacksamt erkänna New England Organ banken för att stödja detta arbete.

Användningen av mänsklig vävnad måste granskas av en institutionell översyn ombord (IRB) eller motsvarande. Arbetet beskrivs här godkändes och förklarades befriad från Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (nr 2011P001496). 1. Lösning Förberedelse <ol><li> Aseptiskt tillskott till fenol röd fritt Williams medium E som anges i tabell 1. Lösningen ska beredas på nytt före användning. Insulin bör läggas strax före användning. </li></ol> 2. Tillbaka Tabell Beredning av levern <ol><li> Placera en is-fyllda organ skål på en steril, draperad yta. Ta levern från lådan och lämnar den i väskan som kall förvaringslösning. Håll levern mestadels under vatten. </li><li> Identifiera den hepatiska artären (HA), som kommer att vara beläget distalt i förhållande till aorta plåstret. Dissekera gratis artären för att avslöja olika skurna grenar längs längden med hjälp Metzenbaum sax. Noggrant dissect hela längden av artären för att avskilja ett kärl som försörjer levern. Skär inte eller binda grenar som inte har en synlig ände. </li><li> Knyt av alla arteriella grenarna inte levererar levern med hjälp silkessutur allt från storlek 0 till 4-0, beroende på fartygets storlek. Stäng grenar som är för kort för att binda eller hål i artären med en söm på 7-0 prolene. Tie och skär mjälte och vänstra gastric artärerna nära sitt ursprung på celiaki stammen. </li><li> Ta aorta plåstret genom att skära celiaki stammen direkt under plåstret. Kanylera celiaki stammen med hjälp av aortakanylen. </li><li> Identifiera portalvenen (PV) och rakt på sak dissekera det är gratis. Knyt bort eventuella grenar och kanylera PV med den förberedda segmentet storlek 24 slang. </li><li> Avlägsna sektioner av membranet från suprahepatic hålvenen, utan att skära venen själv. Utflöde från vena cava avlopp direkt i orgelkammaren. </li><li> Klipp 2 full omkrets tissue prover (2-3 mm längd) från slutet av gallgången; snäpp frysa ett i flytande kväve (förvaras vid -80 ° C) och lagra den andra i 10% buffrad formalin, för vävnad och histologisk analys, respektive. Kanylera gallgången med fartyget kanylen och ett dräneringsrör av membranoxygenatorer slang. </li><li> Identifiera och ligate cystisk kanalen med en 0 sidenslips. Den cystisk kanal hittas mellan gallgången och gallblåsan. </li><li> Anslut flush slang inställd på iskalla påsar av Ringer-laktat (LR) lösning och prime slangen, ta bort all luft. </li><li> Ställ flödesregulatorn på flush slangen till en långsam rännil. Före anslutning av flush slangen till portalen ven kanylen, täppa portalvenen med fingrarna på hilum och fylla kanylen och ven med flush för att avlägsna luften från portalen ven. Höj inte påsen mer än 20 cm över höjden på levern under kalla spolning för att undvika överdrivet tryck påven. </li><li> Under flush kort täppa PV vid den lägsta punkten. Undersök PV efter läckor. Kärlförgreningar kan stängas såsom beskrivits ovan. Spola levern genom PV med totalt 2 L iskall LR. </li><li> Upprepa steg 2,10, 2,11 för HA med 1 L av LR. </li></ol> 3. Förbered SNMP System <ol><li> Prime perfusionen anordningen genom tillsats 2 L av perfusat (21 ° C) till organ skål och börjar anordningen att prima slangen. Följ enhetens instruktion att förbereda för perfusion, inställning av temperaturen till 21 ° C. Börja med tryck av 3 mmHg och 30 mmHg på PV och HA, respektive. Öppna gastank och inställd på ett flöde av 3 l / min. </li><li> Ta ett blodprov gas från både HA och PV inflöde genom att rita en 0,3 ml prov från provportarna och kör den i blodgasanalys maskin enligt tillverkarens anvisningar. Bekräfta adekvat syresättning (PO 2&gt; 700 mmHg) och pH (7,35-7,45). </li><li> Innan levern är ansluten tar en 1,0 ml prov av perfusatet som vid = 0 mätning i ett Eppendorf-rör och förvara vid -80 ° C. Skär två ± 250 mg kil biopsier från levern med hjälp av en enda kanter stålblad; snap frysa en i flytande kväve (förvaras vid -80 ° C) och lagra den andra i 10% formalin. Väg levern före perfusion. </li></ol> 4. Human leverperfusion <ol><li> Överför levern till enheten. Anslut PV inflödet till PV kanylen, efter avlägsnande luft från PV som i steg 2.10. Anslut HA på ett liknande sätt. Ställ PV och HA tryck till 3 och 30 mmHg. Levern bör nästan nedsänkt med perfusat. Täck eventuella torra ytor, inklusive inflödes fartyg, med våt steril gasbinda för att förhindra uttorkning </li><li> Låt gallan slangen avloppet i en uppsamlingsbehållare. Se till öppnandet av galla avlopp är i nivå med levern eller lägre för att tillåta galla att köra oUT fritt. </li><li> Target flöden är 275-325 ml / min.kg och 50-100 ml / min.kg för PV och HA respektive när levern har värmts till 21 ° C. Eftersom varje levern reagerar olika på perfusion, övervaka flödet noggrant under de första minuterna. Öka eller minska trycket på någon av fartygen, om målet flöden inte nås. Överskrid inte 50 mmHg på HA och 5 mmHg på PV. </li><li> Prover kan tas från levervävnaden, perfusat och galla vid utredare preferens. Vi rekommenderar minst följande provsamling regim under perfusion. <ol><li> Vävnadsbiopsier, n = 2 x 250 mg, varje timme. Lagring: snap frysa en i flytande kväve och förvara vid -80 ° C långsiktigt. Dessutom ta en annan biopsi före och efter perfusion och fixa i 10% formalin (n = 1) </li><li> Perfusionsvätskan prover, n = 2x 1 ml, var 15 min under den första timmen och var 30 min därefter. Rita prover från PV inflåg provport. Förvaring: -80 ° C långsiktigt. </li><li> Blodgasanalys av PV och HA inflöde, och hålvenen utflöde. n = 3 x 0,3 ml, var 30 min. Rita prover från både PV och HA provportar. Rita en 0,3 ml prov från hålvenen genom att sätta in en spruta i venen och direkt kör i blodet gasanalysator. Använd produktionen för att säkerställa tillräcklig syresättning och pH. </li><li> Gallproduktion, n = 1 x 1 ml, varje timme. Kvantifiera Visuellt gallproduktion varje timme och ta ett prov från uppsamlingsbehållaren. Förnya behållaren efter provtagningen. Lagring: torris och -80 ° C långsiktigt. </li></ol></li><li> Fortsätt perfusion under 3 timmar. Övervakning av trycket, pH och syresättningen och ta prover hela. Justera han pH genom tillsats av natriumbikarbonat till perfusatet. </li><li> Vid slutet av perfusionen ta de slutliga proven medan levern är perfusion. Koppla levern och ta gallgången kanylen. Ta två post-perfusion vävnadsprover från dengallgången som beskrivits tidigare för lagring vid -80 ° C och i 10% buffrad formalin. </li><li> Kasta den mänskliga levern efter riktlinjer korrekt biohazard avfallshantering. </li></ol>

<ol>
	<li>Merion, R. M., Pelletier, S. J., Goodrich, N., Englesbe, M. J., Delmonico, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+after+cardiac+death+as+a+strategy+to+increase+deceased+donor+liver+availability.">Donation after cardiac death as a strategy to increase deceased donor liver availability.</a> Ann Surg. 244 (4), 555-562 (2006).</li><li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+machine+preservation+facilitates+successful+transplantation+of+'orphan'+extended+criteria+donor+livers.">Hypothermic machine preservation facilitates successful transplantation of 'orphan' extended criteria donor livers.</a> Am J Transplant. 15, 161-169 (2015).</li><li>Dutkowski, P., Schlegel, A., de Oliveira, M., M&#252;llhaupt, B., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOPE+for+human+liver+grafts+obtained+from+donors+after+cardiac+death.">HOPE for human liver grafts obtained from donors after cardiac death.</a> J Hepatol. 60 (4), 765-772 (2013).</li><li>Dutkowski, P., Clavien, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutions+to+Shortage+of+Liver+Grafts+for+Transplantation.">Solutions to Shortage of Liver Grafts for Transplantation.</a> Br J Surg. 101 (7), 739-774 (2014).</li><li>Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+Normothermic+Liver+Perfusion:+An+Update.">Ex-vivo Normothermic Liver Perfusion: An Update.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).</li><li>Monbaliu, D., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+Perfusion+of+the+Liver:+Past,+Present,+and+Future.">Machine Perfusion of the Liver: Past, Present, and Future.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 160-166 (2010).</li><li>Matsuno, M., Uchida, K., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Machine+Perfusion+Preservation+of+Liver+Grafts+From+Donation+After+Cardiac+Death.">Impact of Machine Perfusion Preservation of Liver Grafts From Donation After Cardiac Death.</a> Transplant Proc. 46 (4), 1099-1103 (2014).</li><li>Schlegel, A., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypothermic+machine+perfusion+in+liver+transplantation.">Role of hypothermic machine perfusion in liver transplantation.</a> Transplant Int. , (2014).</li><li>Op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers.">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> Am J Transplant. 13, 1327-1335 (2013).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+prophylaxis+in+(sub)normothermic+organ+preservation:+In+vitro+efficacy+and+toxicity+of+cephalosporins.">Antibiotic prophylaxis in (sub)normothermic organ preservation: In vitro efficacy and toxicity of cephalosporins.</a> Transplantation. 95 (8), 1064-1069 (2013).</li><li>Post, I. C., Dirkes, M. C., Heger, M., Bezemer, R., van't Leven, J., van Gulik, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+flow+and+pressure+management+in+machine+perfusion+systems+for+organ+preservation.">Optimal flow and pressure management in machine perfusion systems for organ preservation.</a> Ann Biomed Eng. 40 (12), 2698-2707 (2012).</li><li>Post, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+preservation+at+hypothermic+to+normothermic+conditions+using+clinical+and+experimental+organ+preservation+solutions.">Endothelial cell preservation at hypothermic to normothermic conditions using clinical and experimental organ preservation solutions.</a> Exp Cell Res. 319 (17), 2501-2513 (2013).</li><li>Klein, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Donation+and+Utilization+in+the+United+States,+1999-2008.">Organ Donation and Utilization in the United States, 1999-2008.</a> Am J Transplant. 10 (4), 973-986 (2010).</li><li>Jay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Increased+Costs+of+Donation+After+Cardiac+Death+Liver+Transplantation.">The Increased Costs of Donation After Cardiac Death Liver Transplantation.</a> Ann Surg. 251 (4), 743-748 (2010).</li><li>Seehofer, D., Eurich, D., Veltzke-Schlieker, W., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+Complications+After+Liver+Transplantation:+Old+Problems+and+New+Challenges.">Biliary Complications After Liver Transplantation: Old Problems and New Challenges.</a> Am J Transplant. 13, 253-265 (2013).</li><li>Morrissey, P., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donation+After+Circulatory+Death:+Current+Practices,+Ongoing+Challenges+and+Potential+Improvement.">Donation After Circulatory Death: Current Practices, Ongoing Challenges and Potential Improvement.</a> Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).</li><li>Verdonk, R., Buis, C., Porte, R., Haagsma, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+complications+after+liver+transplantation:+A+review.">Biliary complications after liver transplantation: A review.</a> Scand J Gastroenterol. 41, 89-101 (2006).</li><li>Pine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Transplantation+Following+Donation+After+Cardiac+Death:+An+Analysis+Using+Matched+Pairs.">Liver Transplantation Following Donation After Cardiac Death: An Analysis Using Matched Pairs.</a> Liver Transpl. 15 (9), 1072-1082 (2009).</li><li>Sutton, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+for+viability+assessment+of+discarded+human+donor+livers+during+ex+vivo+normothermic+machine+perfusion.">Criteria for viability assessment of discarded human donor livers during ex vivo normothermic machine perfusion.</a> PLoS One. 11, e110642 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnormothermic+Machine+Perfusion+for+Ex+Vivo+Preservation+and+Recovery+of+the+Human+Liver+for+Transplantation.">Subnormothermic Machine Perfusion for Ex Vivo Preservation and Recovery of the Human Liver for Transplantation.</a> Am J Transplant. 14, 1400-1409 (2014).</li><li>Bruinsma, B. G., Yarmush, M. L., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organomatics+and+organometrics:+Novel+platforms+for+long-term+whole-organ+culture.">Organomatics and organometrics: Novel platforms for long-term whole-organ culture.</a> Technology. 02 (1), 13-22 (2014).</li><li>Berendsen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+subnormothermic+machine+perfusion+system+restores+ischemically+damaged+liver+grafts+in+a+rat+model+of+orthotopic+liver+transplantation.">A simplified subnormothermic machine perfusion system restores ischemically damaged liver grafts in a rat model of orthotopic liver transplantation.</a> Transplant Res. 1 (1), 6 (2012).</li></ol>

Drs. BE Uygun, K Uygun och Yarmush är uppfinnare på en pågående patent som är relevant för denna studie (WO / 2011 / 002.926), och Dr.. BE Uygun, K Uygun och Yarmush är uppfinnare på en pågående patent som är relevant för denna studie (WO / 2011/35223). Drs. K Uygun och Bruinsma har en provisorisk patentansökan i samband med detta arbete. Dr K Uygun och BE Uygun har ett ekonomiskt intresse i Organ Solutions, fokuserade företaget på att utveckla organpreservation teknik. Dr K Uygun och BE Uygun intressen hanteras av MGH och Partners Health i enlighet med sin intressekonflikter politiken.

I ett försök att återvinna levrar skadade under ischemi utvecklade vi ett SNMP-system som kan användas efter en period av kylförvaring. Subnormothermic maskin perfusion erbjuder ett lönsamt alternativ till konventionell kylförvaring, samt hypotermiska och normotermisk maskin perfusion modaliteter. Existerar Olika olika system; alla erbjuder olika fördelar och nackdelar 3,9,20. SNMP möjliggör perfusion utan en syrebärare, som metaboliska syrekrav på 21 ° C möts av aktivt syresättning av perfusatet. Även reduceras under subnormothermic förhållanden, är ämnesomsättningen betydande och kräver stöd av en näringsrik perfusion lösning. Traditionella perfusionslösningar, såsom Belzer maskin perfusionslösningen, är i allmänhet minimal i sammansättning och är avsedda för kall perfusion. Williams Medium E har använts som en hepatocyt odlingsmedium under många år, och innehåller components som är universella för att stödja cellulär funktion, särskilt under varma ex vivo förhållanden. Mätningar som gjorts under maskin perfusion är reflekterande av funktionen av organet. Direkt observer parametrar såsom galla produktion och syreupptagning är realtidsmätningar som kan användas för att bedöma lever pre-transplantation. På samma sätt kan markörer för cellskada och ischemi (K +, laktat release) mätas direkt i perfusion lösningen och kan tyda på organfunktion 20. Som maskin perfusion teknik utvecklas ytterligare och uppnår mer utbredd klinisk tillämpning, kan korrekta korrelationer mellan ex vivo funktion och kliniskt utfall göras och perfusion parametrar kommer att vara till nytta i att bistå beslut att transplantera eller avvisa marginell kvalitet lever. Dessutom som punkt-vård analysverktyg förväg, kommer mer sofistikerad analys blir tillgängliga direkt under maskinen perfusionen 21. I detta arbete visar vi att lever kan stödjas i SNMP-system med minimal skada på levern, reflekteras av histologi och frisättning av ALAT. Funktionell återhämtning av levern bäst reflekteras av ATP, vilket har visat sig korrelera till lever livskraft och är starkt tyder på transplantation framgång i djurmodeller 22. Ex vivo och pre-transplantation återhämtning av levertransplantat skulle tillåta en betydande expansion av givaren lever pool, korrigera skillnaden mellan utbud och efterfrågan på givar levrar vid transplantation.

Levertransplantation är den enda botande behandlingen för tiotusentals patienter som lider av slutstadiet leversjukdom. För att underlätta lyckad transplantation, optimalt bevarande av levern från den tid det anskaffas från givaren tills den tidpunkt då det implanteras i mottagaren är nödvändig för att förhindra snabb försämring av transplantatet. Den nuvarande standarden för lever konservering kallas &quot;statisk kylförvaring &#39;: levern kyls i en iskall konservering lösning, vilket minskar metabolismen av levern och bromsa de skadliga effekterna av ischemi. Även om denna kylförvaring teknik har möjliggjort lyckad transplantation, organ marginell kvalitet såsom DCD organ skadats av varm ischemi eller steatos show sämre behandlingsresultat 1. Det är ett snabbt växande mängd bevis som ex vivo maskin perfusion av levertransplantat som alternativ konservering modalitet kan potentiellt imbevisar utfall för dessa marginella organ 2,3. Levertransplantation har blivit ett offer för sin egen framgång. Långt fler patienter remitteras för transplantation än det finns lever tillgängliga och tusentals dör på väntelistan i USA varje år. Med tanke på den verklighet givarleverbristen och den ökande användningen av levertransplantat av suboptimal kvalitet för behövande mottagare, är det allmänt ansett att ex vivo maskin perfusion av levertransplantat före implantation håller löftet om ett paradigmskifte i levertransplantation. Det har skett en markant ökning av intresset forskningen i detta ämne under de senaste åren 4-8. I flera europeiska och nordamerikanska centra hypotermi maskin perfusion har gjort en klinisk introduktion 8 och normotermisk maskin perfusion vid fysiologiska temperaturer har nyligen tillämpats på kasse mänskliga levrar och översätts till klinisk användning samt 9.Omfattande utveckling har lett till utvecklingen av olika protokoll, medan kontinuerlig optimering identifierar den optimala perfusion Parametrar 10-12. Användning av marginell kvalitet transplantat har ökat mer än 10 gånger under det senaste årtiondet 13. Jämfört med den nuvarande standarden för lever konservering (statisk kylförvaring), ger ex vivo maskin perfusion många potentiella fördelar, som alla leder till välbehövlig utbyggnad av organpoolen och en potentiellt minskning i incidensen av posttransplantationskomplikationer. I synnerhet de gallvägarna komplikationer som för närvarande plågar levertransplantat suboptimal kvalitet efter transplantation förbli en betydande fråga 14-18. Maskin perfusion vid subnormothermic förhållanden ger ett tidsfönster för att bedöma transplantatfunktion objektivt som till lämplighet för transplantation 19. Medan levern är perfusion i en ex vivo krets, både perfusatet and gallan som produceras under perfusion kan provtas för mätning av markörer för organfunktion. På detta sätt &quot;allvarligt äventyras&quot; lever som kastas för transplantation enligt de nuvarande kriterierna objektivt kan bedömas med avseende på deras lämplighet för transplantation. Viabiliteten bedömning potentiellt medger många av dessa organ för att utnyttjas för transplantation. En lika kraftfull fördel med maskin perfusion är reparation och förbättring av levrar som har skadats av varm / kall ischemi. ATP utarmas mycket snabbt under varma och efterföljande kall ischemi och kan repleted under en period av maskin perfusion före implantation av levern 20. Levern, med sina energiaffärer och metabola tillstånd fyllas, är konditioneras och bättre förberedda för de skadliga verkningarna av reperfusionsskada efter implantation i mottagaren. Detta arbete beskriver en metod för ex vivo maskin perfusion av human lever grafts i laboratoriet, vilket kommer att vara till nytta för forskare som vill studera både tekniken och positiva effekter av ex vivo maskin perfusion. Vi använder oss av humana donator lever som har minskat för transplantation och därefter tilldelats för forskningsändamål. Standardlever upphandling teknik innebär på plats arteriell spola av levern efter aortatvärkläm i hjärndöda donatorer (DBD) eller efter cirkulationsstillestånd i cirkulationsdöds donatorer (DCD), som beskrivs mer i detalj på annan plats 20. Dessutom är levern kyls under upphandlingen genom att fylla givarens bukhålan med is. Spola lösning preferenser varierar mellan regionerna, med majoriteten av upphandlingar med hjälp av University of Wisconsin eller histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) lösning. En extra back-tabellen flush av portalen ven förbättrar washout av resterande blod. Lever ofta upphandlas lämnar en aortasegment suravrundning celiaki stammen. Gallblåsan är snittas, galla sugs och gallgången spolas. Lever är förpackade i sterila påsar innehållande iskall konservering lösning och transporteras i utsedda lådor eller kylare. För representativa resultat varm och kall ischemi tid bör begränsas till 60 minuter och 12 timmar, respektive. Trots rutin serologisk screening för överförbara patogener, måste standard försiktighetsåtgärder vidtas vid överlämnandet mänskliga organ, prover från mänskliga organ, och restprodukter. Protokollet här beskriver subnormothermic maskin perfusion med ett kommersiellt tillgängligt leverperfusion enhet. Användning av en sådan anordning möjliggör snabbare översättning till den kliniska inställningen och kors validering av olika protokoll och enhetsinställningar bland forskargrupper och transplantationscentra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Assist perfusion device</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Assist disposable set</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist disposable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1878&#8211;6x500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co</td>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>MGH pharmacy</td>
			<td>7750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ZO2OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty gas regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y11244D580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2324X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>316-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Adson forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debakey tissue forceps, 7.75&#8221;, 2.25 mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors 7&#34; Curved SureCut Tungsten</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6965SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle holder 5.5&#8211;7&#8221;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 blackbraided silk sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA66G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>C554D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood gas analysis machine</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidPoint 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance scale</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-10000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure display box</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pressure display sets</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>61000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td colspan="2">EW-91500-04 and EW-08516-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>30005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irrigation set flush tubing</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>06543-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing bowl, 4L</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07300-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

Ett antal observationer och analyser kan utföras på levern under perfusionen, inklusive direkta realtids observationer, såsom flödeshastigheter och galla produktion; realtidsmätningar, såsom gas-analys av perfusatet, och post-hoc mätningar som är gjorda efter provtagningen inklusive biokemisk analys av perfusatet och vävnad och histologisk analys. Resultat som nämns här är från 22 perfusion humana levrar. Lever avvisades för transplantation av olika skäl, bland annat givar ålder, överdriven varm ischemisk tid, biopsiresultat (steatos, inflammation, fibros) och av logistiska skäl. 18 levrar upphandlades efter hjärtdöd och 4 efter hjärndöd. I båda fallen var donatorer förbehandlade med 30.000 enheter heparin och spolas in situ och på baksidan bordet med UW-lösning. Genomsnittlig kalla ischemisk tid var 531 ± 237 (SD) min och den genomsnittliga varma ischemisk tid var 27 ± 10 (SD) min, mätt från indragning av livetstöd till kall spolning. Realtid observationer och mätningar kan användas för att bedöma levern under perfusionen, medan post-hoc mätningar avslöjas efter perfusionen. Realtids observationer Flöde genom levern börjar lägre än mål-flödeshastigheter, som en följd av ett högre motstånd i den kalla levern. Använda ett tryck på 3 mmHg på PV och 30 mmHg på HA målgruppflödena allmänhet kan uppnås när levern har värmts upp till 21 &#160; ° C efter 60 min av perfusion (Figur 1A). Gallflöde kan generellt observeras inom 10 minuter från perfusion och produceras stadigt under perfusion (Figur 1B). Bile kvantitet beror på kvaliteten av levern och varierar från 0,3 ml / h / kg lever till 18 ml / min / kg. I lever med längre varm ischemisk tid, kommer gallflöde tenderar att avta, medan kortare varma ischemiska tid resulterar i en mer stabil eller till och med ökargallproduktion. Mätningar Realtids Direkt och frekvent mätning av perfusatet genom blodgasanalys i väsentlig för både experimentellt syfte samt upprätthålla adekvata perfusion, viktigare syresättning och pH. Löst syre partialtryck bör vara större än 700 mmHg om inflödet av både PV och HA. Utflöde syrgastryck, mätt i hålvenen, minskar generellt med längre perfusion, vilket återspeglar en ökad syreupptagning. Syreupptagningshastigheterna kan beräknas som beskrivits tidigare 13 och varierade från 0,5 till 2,2 ml O 2 / min / kg i början av perfusionen till 2,4-9,7 ml O 2 / min / kg vid t = 3 h (figur 1C). En droppe i pH observeras i den första 30 min (figur 1D), främst till följd av laktat release i perfusatet. Detta kan stödjas av tillskott med 8,4% natrium bicarbonate och efter ca 90 min pH faller tillbaka i det normala intervallet. Vanligen är från 30 till 50 ml av 8,4% natriumbikarbonat krävs. Laktatkoncentration ökar snabbt i den första 15 till 30 minuter, men börjar att avlider efter den första timmen (figur 1E). Post-hoc mätningar Levertransaminaser såsom ALAT kan mätas i perfusatet. Under de första 30 min en stor ökning av ALAT observeras i allmänhet som återspeglar washout av ALT som släpptes under ischemi (figur 1F). ALT visats korrelera väl med varmt ischemisk tid 13. Maskin perfusion ökade ATP halt 2,8 gånger, vilket återspeglar en återhämtning energistatus (figur 1G). H &amp; E histologisk analys avslöjar ingen ytterligare skada under maskin perfusion (Figur 1H, I). Det bör noteras att den biopsi regimen föreslås i detta protokoll är för research ändamål och får inte tillämpas för kliniska ändamål. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figur 1:. Bedömning av mänskliga levrar under maskin perfusion Flödet genom PV och HA under SNMP (A), galla produktion, kvantifieras per timme av perfusion (B), syre höjningen hastighet (OUR), räknat från skillnaden i inflödet (PV + HA) och utflöde (hålvenen), avbruten linjerna visar partiella syretrycket i in- och utflöde under perfusion (C), pH och laktat under perfusion (D, E), frigörande av ALAT i perfusatet (F), ATP innehåll mätt i vävnad från timvisa biopsier (G) och H &amp; E fläckar i levern (54 år gammal DCD, 19 min varm ischemi, 559 min kall ischemi) före (H) och efter (I) perfusion. Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion at JoVE.com

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Vi beskriver en metod för ex vivo maskin perfusion av humana levertransplantat vid subnormothermic temperatur (21 ° C).

Funktionell Human Liver Bevarande och inkassering av belopp genom Subnormothermic Machine Perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Teknik för Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Leverperfusion för lagring, Bedömning och Reparation av begränsade lever Grafts

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Förfarande för mänskliga vena Vener<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusion och extern Förstärkning

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolerade lever Perfusion som behandling för levermetastaser av Uveal Melanom

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex situ normotermisk Machine Perfusion av donator Lever

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex vivo</em&gt; Njure Perfusion för bevarandet av Njure transplantat före transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering av en humaniserad muslever Använda Human lever stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Metod för Direct segment Intra-lever Delivery hjälp av en råttlever hilar Clamp Modell

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En liten djurmodell för Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

Dynamisk navigering i endodonti: guidad förberedelse av åtkomsthålighet med hjälp av ett miniatyriserat navigationssystem

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion för bevarande av Pancreas Allografts före transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...