Name: measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique
Uploaded: 2015-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique at JoVE.com

This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. ايون انتقائية إعداد مسرى مكروي-الرجوع الذاتي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ايون انتقائية مسرى مكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة سحب رقيقة الشعرية البورسليكات الجدران من دون خيوط (1.5 ملم القطر الخارجي، 1.12 مم ال?...

الخطوات الأكثر أهمية لقياس النجاح في تدفقات أيون الخلية في الجسم الحي هي: الحد من الضوضاء، وتلفيق الصحيح للالميكروية ايون انتقائية والمرجعية القطب، وتحديد المواقع من العينة وكل من الأقطاب الكهربائية. من أجل الحد من الضوضاء...

<html> ويحيط كل الخلايا الحيوانية التي كتبها طبقة ثنائية الغشاء الدهني الذي يفصل السيتوبلازم من البيئة الخارجية. تحتفظ الخلية إمكانات غشاء الكهربائية، سلبية في الداخل، عن طريق النقل النشط لأيونات 1. غشاء المحتملة هي مصدر الطاقة المخزونة التي الخلية يمكن الاستفادة لتشغيل الأجهزة الجزيئية المختلفة في غشاء 2. الخلايا العصبية والخلايا منفعل أخرى لديها إمكانات غشاء كبيرة. افتتاح السريع للقنوات الصوديوم ينهار غشاء المحتملة (الاستقطاب) وتنتج إمكانات العمل التي يتم نقلها على طول العصبون 2. وبصرف النظر عن هذه التغييرات الكهربائية السريعة، والعديد من الأنسجة والأعضاء تولد والحفاظ على إمكانات كبيرة الكهربائية على المدى الطويل. على سبيل المثال، والجلد وظهائر القرنية توليد والحفاظ على الإمكانات عبر الظهارية والتيارات الكهربائية خارج الخلية من خلال ضخ الاتجاه من الأيونات (أساسا الصوديوم وكلوريد) 3. خيمة &quot;&gt; بينما قياسات الذاتية التيار الكهربائي خارج الخلية باستخدام مسبار تهتز 4-6 وقياسات غشاء أو عبر الظهارية إمكانات استخدام نظام مسرى مكروي 10/7 يتيح قياس المعلمات الكهربائية لأغشية الخلايا وطبقات الخلايا الظهارية، فإنها لا تعطي إشارة إلى الأنواع أيون المعنية. يمكن الميكروية مع حامل الأيون انتقائية قياس تركيز أيون معين في الحل. يمكن قياس التدرجات أيون أو التمويه مع اثنين أو أكثر من الأقطاب الكهربائية في مواقع مختلفة. ومع ذلك، فإن الانجراف الجهد لا يتجزأ من كل مسبار تكون مختلفة، مما تسبب قياسات غير دقيقة أو حتى الكشف عن الانحدار الذي لم يكن موجودا. A القطب واحد المستخدمة في وضع &quot;الرجوع إلى الذات&quot; حيث أنه يتحرك في التردد المنخفض بين نقطتين يحل هذه المشكلة. الآن تدفق الأيونات يمكن أن ينظر إليه على خلفية الانجراف إشارة بطيئة وثابتة نسبيا (انظر الشكل 3B). </P&gt; يستخدم نظام قياس حساسة ليثيوم-الميكروية الرجوع النفس ايون الانتقائي للكشف عن تدفقات خارج الخلية صغيرة من الأيونات قريبة من الأنسجة أو الخلايا وحيدة. ويتكون النظام من مكبر للصوت الذي يعالج الإشارة من مسرى مكروي والسائر المحركات الصغيرة والسائق للسيطرة على حركة مسرى مكروي. يتم توصيل مسرى مكروي ايون انتقائية والقطب المرجعية التي تغلق الدائرة إلى مكبر للصوت عن طريق headstage قبل مكبر للصوت (الشكل 1A). برامج الكمبيوتر يحدد معالم الحركة مسرى مكروي (تردد، وبعد المسافة) ويسجل أيضا إخراج مكبر للصوت. يتحكم المحرك السائر حركة مسرى مكروي عبر micropositioner ثلاثي الأبعاد. وقد تطورت A التردد المنخفض تهتز ايون انتقائية مسرى مكروي لأول مرة في 1990 لقياس تدفق الكالسيوم محددة 11. وكذلك الكالسيوم والكوكتيلات حامل الأيون الوصول تجاريا متاحة الآن لجعل ميكرoelectrodes حساسية للصوديوم وكلوريد البوتاسيوم والهيدروجين والمغنيسيوم، نترات الأمونيوم، الفلورايد، والليثيوم أو الزئبق. في الأساس، وايون انتقائية تقنية مسرى مكروي-الرجوع النفس تحويل نشاط أيون معين المذاب في محلول إلى الجهد الكهربائي، والتي يمكن أن تقاس الفولتميتر. كوكتيل حامل الأيون هو السائل إمتزاج (العضوية، محبة للدهون) المرحلة مع خصائص التبادل الأيوني. على حامل الأيون مجمعات انتقائي (الربط) أيونات معينة عكسية ونقل لهم بين محلول مائي الواردة في مسرى مكروي (بالكهرباء) ومحلول مائي التي يتم مغمورة مسرى مكروي (1D الشكل). هذا نقل أيون يؤدي إلى التوازن الكهروكيميائية ويتم قياس الاختلاف من الجهد الكهربائي بين مسرى مكروي والقطب المرجعية من قبل الفولتميتر. الجهد يتناسب مع لوغاريتم النشاط أيون معين وفقا لنرنست هquation السماح للحساب تركيز أيون (الشكل 2A و B). في الوقت الحاضر، العديد من النظم تسمح قياس تدفق الأيونات باستخدام مفهوم أو مبدأ مماثل. على سبيل المثال، القطب تقنية المسح الضوئي ايون انتقائية (SIET) 12،13 أو مسرى مكروي ايون الجريان تقدير (MIFE) تقنية وضعتها نيومان وShabala 14-16 متاحة تجاريا وتستخدم على نطاق واسع من قبل الأوساط البحثية من أجل تحديد أيون محدد الطلاءات التي تحدث في غشاء الخلايا والأنسجة عبر مجموعة متنوعة من الحيوانات والنباتات ونماذج خلية حية واحدة. وقد استخدمت الميكروية ايون انتقائية لقياس الهيدروجين والبوتاسيوم والكالسيوم تدفق عبر جذور النباتات 17، تدفق الكلوريد في الفئران الشرايين الدماغية 18 و 19 في أنابيب حبوب اللقاح، تدفق الهيدروجين في خلايا الشبكية تزلج 20، تدفق الكالسيوم في العظام بالنسبة للفئران 21، أيون مختلف الفيض في خيوط فطرية 22 و في صفي القرنية 23، وأخيرا تدفق الكالسيوم خلال الجرح خلية واحدة الشفاء 12،24. انظر أيضا الاستعراض التالي للحصول على معلومات مفصلة على الرجوع النفس الميكروية ايون الانتقائي 25. تتناول المقالة التالية بالتفصيل كيفية إعداد وتنفيذ قياس الذاتية تدفقات أيون الخلية باستخدام-الرجوع النفس تقنية مسرى مكروي ايون انتقائية على مستوى خلية واحدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IonAmp&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonAmp32&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage pre-amplifier</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>INA116</td>
			<td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroStep Driver</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micropositioner&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>Model KITE-R</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Model M10</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table&#160;&#160;</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model VW-3036-OPT-023040</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&#176;, slotted faces</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model 360-90</td>
			<td>Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>460PD-X</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td>
			<td>Newport Inc.</td>
			<td>460A-XY</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>&#160;PC-10</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal rack</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>none</td>
			<td>Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>QL</td>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85126</td>
			<td>Hazardous, handle as recommended by provider&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish; Pyrex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode/micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>E215</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-595E</td>
			<td>Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597722</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S97329</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QSW-A15P</td>
			<td>with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3S</td>
			<td>with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60872-306</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh</td>
			<td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td>
			<td>NTX750</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue; Loctite epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500043-451</td>
			<td>Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>99053</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>none</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique

يتم تضمين الخلايا من الحيوانات والنباتات والخلايا واحدة بحاجز يسمى غشاء الخلية التي تفصل بين السيتوبلازم من الخارج. طبقات الخلية مثل ظهائر أيضا تشكيل الحاجز الذي يفصل بين الداخل من الخارج أو حجرات مختلفة من الكائنات المتعددة الخلايا. ومن السمات الرئيسية لهذه الحواجز هي توزيع الفرق الأيونات عبر أغشية الخلايا أو طبقات الخلية. خاصيتين تسمح هذا التوزيع: 1) الأغشية وظهائر عرض النفاذية الانتقائية للأيونات محددة؛ 2) يتم نقل الأيونات خلال مضخات عبر أغشية الخلايا وطبقات الخلية. هذه الخصائص تلعب دورا حاسما في الحفاظ على وظائف الأعضاء والأنسجة بمثابة إشارات العظة بعد الضرر، خلال إصلاح، أو في ظل حالة المرضية. إلى الرجوع النفس مسرى مكروي ايون الانتقائي يسمح قياسات لتدفقات معينة من أيونات مثل الكالسيوم والبوتاسيوم أو الصوديوم عند مستويات الخلايا والأنسجة واحدة. يحتوي على مسرى مكروي كوكتيل حامل الأيون الذي هوقابلة للاختراق بشكل انتقائي إلى أيون معين. الحل ملء داخلي يحتوي على تركيز مجموعة من الأيونات في المصالح. يتم تحديد الجهد الكهربائي من مسرى مكروي من التركيز الخارجي للأيون. كما يختلف تركيز أيون، وإمكانات مسرى مكروي التغييرات بوصفها وظيفة من سجل النشاط أيون. عندما انتقلت ذهابا وإيابا بالقرب من مصدر أو بالوعة للأيون (أي في التدرج تركيز بسبب تدفق أيون) إمكانية مسرى مكروي يتقلب في اتساع يتناسب مع تدفق أيون / التدرج. مكبر للصوت تضخيم الإشارة مسرى مكروي ويتم تسجيل الإخراج على جهاز الكمبيوتر. ومن ثم يمكن حساب تدفق الأيونات بالقانون فيك من نشر باستخدام تذبذب القطب المحتملين، ورحلة من مسرى مكروي، وغيرها من المعالم مثل حركة الايونات معين. في هذه الورقة، ونحن تصف بالتفصيل منهجية لقياس تدفقات أيون الخلية باستخدام-الرجوع النفس مسرى مكروي لايون انتقائيةد تقديم بعض النتائج التمثيلية.

لقد أظهرنا سابقا أن تدفق الكالسيوم يظهر بعد خلية واحدة اصابة 24 اخرين. لذا سألنا عما إذا تدفقات ايون أخرى تحدث عند إصابة خلية واحدة. استخدمنا X. المورق البويضة، وهذا نموذج راسخة لخلية واحدة التئام الجروح 30-34 وتسجيل الكهربية 24،35-39. ومن المثير للاهت...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique at JoVE.com

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

قياس خارج الخلية ايون تدفقاتها باستخدام ايون انتقائية مسرى مكروي تقنية الرجوع الذاتي

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

خلاصة من المنحنى الرابع ايون القناة باستخدام مكونات التردد

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

قياس الكالسيوم السريع في تدفقاتها العضلية

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

قياس كمية Invadopodia بوساطة التحلل البروتيني المصفوفة خارج الخلية في سياقات متعددة الخلايا واحدة و

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

توصيف وظيفي نا<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; المبادلات بين الخلايا من المقصورات عن طريق بروتون-مما أسفر عن مقتل اختيار للتعبير عنها في غشاء البلازما

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

تقرير من سطح الخلية النسبي ومجموع التعبير عن قنوات المؤتلف ايون باستخدام التدفق الخلوي

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

إنشاء درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية منظومة الثقافة

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...