Name: do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00
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We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Tissue Ernte und Einfrieren von Muskelgewebe <ol><li> Euthanize die Maus mit einer Überdosis Isofluran (2-Chlor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethan). Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug und verwenden Sie eine Auffangverfahren, wie einem Exsikkator oder einer Glasglocke, die ein Wattestäbchen in Isofluran getränkt. </li><li> Tod Bestätigen fest drückte Fußballen. Verwenden Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie wie Genickbruch. </li><li> Befeuchten Sie das Fell mit 70% Alkohol, um das Anhaften ...

<ol>
	<li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies.">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li><li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica.">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li><li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophy.+I.+History,+clinical+status,+muscle+strength,+and+biopsy+findings.">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li><li>Platzer, A. C., Chase, W. 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A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy.">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li><li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice,+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li><li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy.">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14 (2014).</li><li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis:+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A.">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li><li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy.">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+fixation.">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li><li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections.">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+'gold+standard'+for+immunohistochemistry.">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li><li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia.">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li></ol>

Histologie und Immunhistochemie wurden als wichtige Instrumente für das Verständnis der Manifestation und Progression der Pathologie in verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen eingesetzt. Klassischerweise wurden Muskelbiopsien ersten in Formaldehyd fixiert und dann mit Paraffinwachs eingebettet. Während Formaldehydfixierung bewahrt Gewebearchitektur und ermöglicht Gewebe Lagerung und Transport bei RT, inaktiviert es auch Enzyme und Proteine ​​Vernetzungen erfordern weitere Schritte, um genaue Immunfärbung z...

Prüfung der Muskel Histologie spielt eine entscheidende Rolle für das Verständnis der verschiedenen Arten von neuromuskulären Störungen 1-4. Wenn sie mit anderen Techniken kombiniert, erlaubt es Forschern, eine bessere Vorstellung von der Manifestation und Progression der Pathologie zu bekommen und kann auch wichtig sein, um die Wirksamkeit eines therapeutischen Interventions 5-10 bewerten. Jedoch genau zu sein, müssen die Gewebe in der richtigen Art und Weise gespeichert, die den physiologischen Zustand unmittelbar vor dem Herausschneiden erhalten. Dies erfordert große Sorgfalt bei der Entnahme, Konservierung, Schnitte, und Färbung. Gewebe können auf zwei verschiedenen Wegen für lichtmikroskopische Untersuchung vorbereitet werden. Das erste Verfahren, Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Abschnitten erfordert Gewebe in 10% gepuffertem Formaldehyd natürlichen bevor sie mit Paraffin eingebettet 11,12 fixiert werden. Der Fixierungsschritt hilft, Morphologie besser zu bewahren, sondern auch Querverbindungen endogenen proteins macht es erforderlich komplizierte Antigen-Retrieval-Verfahren für die Immunfärbung und die Beseitigung der Möglichkeit der enzymatischen Flecken auf solche Abschnitte 12. Gefrierschnitte andererseits brauchen nicht vor, eine feste oder verarbeitet werden sollen; daher sind Proteine ​​in der Lage, native biologische Konformationen 13,14 beibehalten. Ferner gefrorene Schnitte auch schnelle Durchlaufzeit, die manchmal notwendig ist, beispielsweise in der intraoperativen Diagnose von Sarkomen und anderen chirurgischen Biopsien 15 ermöglichen. , Wenn nicht richtig gemacht, Diese Methode ist jedoch anfällig für Schäden, die Änderungen an Muskel-Architektur macht die Abschnitte ungeeignet für die histologische Untersuchung stellt einfrieren. Dieses Papier wird die effektivste Methode, um Muskelbiopsien, um eine optimale Färbung für die ordnungsgemäße Prüfung zu erreichen vorbereiten zu skizzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica CM 1850&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 
			Richard Allen Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 50i&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. 
			Phone: +1-631-547-8500 
			Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Nikon Imaging Software Basic Research</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. 
			Phone: +1-631-547-8500 
			Image J, Metamorph</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>14043-220-05</td>
			<td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td>
			<td>JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>4583</td>
			<td>Sakura Inc.</td>
			<td>Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA 
			Leica Microsystem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze It</td>
			<td>23-022524</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable tissue mold</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorfrost plus slides</td>
			<td>9991001</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>650501-4L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>HC-1300-1GL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl butane</td>
			<td>M 32631-SL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HC-7001GA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 280</td>
			<td>8311-4</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Gill #3</td>
			<td>CS402-1D</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis

Histologische Bewertung von Muskelbiopsien wurde als unverzichtbares Instrument für das Verständnis der Entwicklung und Progression von Pathologie der neuromuskulären Erkrankungen serviert. Um dies zu tun, muss jedoch die richtige Pflege, wenn das Ausschneiden und die Erhaltung Gewebe, um eine optimale Färbung erreichen ergriffen werden. Eine Methode der Gewebekonservierung beinhaltet Befestigungs Gewebe in Formaldehyd und dann Einbettung mit Paraffinwachs. Dieses Verfahren bewahrt Morphologie gut und ermöglicht langfristige Lagerung bei Raumtemperatur, ist aber umständlich und erfordert Umgang mit giftigen Chemikalien. Ferner Formaldehydfixierung ergibt Antigen Vernetzung, die Antigen-Retrieval-Protokolle für eine wirksame Immunfärbung erfordert. Im Gegenteil, ist gefrorene Schnitte nicht Fixierung erfordern und somit behält biologischen Antigen-Konformation. Dieses Verfahren stellt auch einen entscheidenden Vorteil in der schnellen Durchlaufzeit, so dass es besonders hilfreich in Situationen, brauchen schnelle histologische Auswertung wie intraoperative chirurgischen Biopsien. Hier beschreiben wir die effektivste Methode zur Herstellung von Muskelbiopsien zur Visualisierung mit unterschiedlichen histologischen und immunologischen Flecken.

Das Set-up für die Ernte und das Einfrieren von Gewebe kann in 1 gesehen werden kann. Entfernte Gewebe sollte auf eine Gaze in PBS eingeweicht, um das Trocknen (1A) zu vermeiden, gespeichert werden. Werden die Gewebe so ausgewählt sind, für die histologische Analyse verwendet werden, sollten in OCT eingetaucht werden und auf Kryo Form gelegt in der richtigen Orientierung und so nahe physiologischen Länge möglichst genaue Morphologie (1B) zu gewährleisten. Aufschl?...

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Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Gebote und Verbote in der Herstellung von Muscle Kryoschnitte für die histologische Analyse

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

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We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
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Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

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When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

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