Name: detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization at JoVE.com

This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés par le IACUC de l&#39;Université Columbia et de lignes directrices applicables pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies. Note: Préparer tous les tampons utilisés pour les procédures de ISH dans l&#39;eau sans RNase ou traitée au DEPC. Cette recommandation est pas strictement nécessaire après ISH est achevée, mais il est suggéré que les tampons sont encore préparés dans de l&#39;eau distillée deux autoclave et / o...

<ol>
	<li>Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+localization+and+local+protein+synthesis+in+nervous+system+assembly,+maintenance+and+repair.">Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).</li><li>Campbell, D. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+responses+of+retinal+growth+cones+mediated+by+rapid+local+protein+synthesis+and+degradation.">Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation.</a> Neuron. 32, 1013-1026 (2001).</li><li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+RhoA+regulates+growth+cone+collapse.">Local translation of RhoA regulates growth cone collapse.</a> Nature. 436, 1020-1024 (2005).</li><li>Piper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+Slit2-induced+collapse+of+Xenopus+retinal+growth+cones.">Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones.</a> Neuron. 49, 215-228 (2006).</li><li>Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+&#946;-actin+mRNA+localization+and+translation+in+Ca2+-dependent+growth+cone+guidance.">An essential role for &#946;-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance.</a> Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).</li><li>Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+elongation+triggered+by+stimulus-induced+local+translation+of+a+polarity+complex+protein.">Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).</li><li>Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+TC10+is+required+for+membrane+expansion+during+axon+outgrowth.">Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth.</a> Nat. Commun. 5, 3506 (2014).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+Is+an+RNA-Binding+Protein,+and+Its+Interactome+Provides+a+Link+to+Neural+Development+and+Microtubule+Assembly.">APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly.</a> Cell. 158, 368-382 (2014).</li><li>Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110, 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141, 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153, 1252-1265 (2013).</li><li>Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+and+retrograde+trafficking+of+CREB+promotes+neuronal+survival.">Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival.</a> Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).</li><li>Ji, S. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+of+SMAD1/5/8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification.">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li><li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+poly(A)+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons.">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li><li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture.">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li><li>Hengst, U., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+translational+regulation+of+mRNA+in+developing+axons.">Function and translational regulation of mRNA in developing axons.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).</li><li>Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+roles+of+local+translation+from+the+axonal+transcriptome.">Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome.</a> Open Biology. 2, 120079 (2012).</li><li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonally+synthesized+ATF4+transmits+a+neurodegenerative+signal+across+brain+regions.">Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions.</a> Cell. 158, 1159-1172 (2014).</li><li>Gumy, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization.">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons.">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li><li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons.">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li><li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse.">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li><li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55 (2014).</li><li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

Dans ce rapport, nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;une technologie de ISH haute résolution dans la détection de l&#39;ARNm axonaux localisée ATF4. Ces précédentes et les études publiées montrent que cette technologie est compatible avec la détection de protéines à base d&#39;anticorps dans les tissus ou même des embryons entiers 33. Surtout, il a été récemment utilisée pour la détection de l&#39;ARNm de l&#39;arc à l&#39;intérieur de dendrites des neurones de l&#39;hi...

Le recrutement d&#39;ARNm axonale et la traduction locale permettent axones à répondre à des stimuli extracellulaires d&#39;une manière temporellement et spatialement aiguë 1. La synthèse des protéines intra-axonal est mieux compris dans le contexte de développement neurologique où elle joue un rôle crucial dans la croissance cône comportement 8.2, 11.9 et des axones signalisation rétrograde 12,13. Mais loin en sait moins sur la signification fonctionnelle de la synthèse des protéines axonale dans les neurones post-développement lorsque les niveaux d&#39;ARNm et de ribosome axonales sont considérablement réduits 14,15. Axones vertébrés matures ont longtemps été pensé pour être inactive translation 16. Cependant, des études récentes indiquent que la traduction locale est réactivé dans les axones matures dans des conditions pathologiques. Par exemple, un sous-ensemble des ARNm est recruté pour axones après une lésion du nerf et de la synthèse des protéines intra-axonal est nécessaire pour la régénération correcte de ces axones 17. En outre, notre ha de groupes a montré que les ARNm spécifiques sont recrutés pour des axones après une exposition locale à la maladie d&#39;Alzheimer peptide Aß 1-42, et de la traduction locale ATF4 facteur de transcription est nécessaire pour propager les effets neurodégénératifs de Aß 1-42 de axones au soma neuronal 18. Enfin, les analyses à haut débit ont révélé que les axones matures ont un transcriptome plus complexe et dynamique que prévu 18-21, en ​​particulier dans des conditions pathologiques. À la lumière de ces études, une méthode hautement sensible et spécifique pour détecter les ARNm axonaux localisées dans le système nerveux adulte est nécessaire. Une grande partie du travail sur le recrutement de l&#39;ARNm et la traduction locale dans les axones matures a été effectuée sur des neurones en culture. Cela est particulièrement vrai pour les analyses de transcriptome car les méthodes de culture spécialisés existent qui permettent l&#39;isolement des axones de la somato-dendritique compartiment 18-20. Bien que ces études ont donné ins précieusesight dans le rôle de la traduction locale dans les axones matures, la question de savoir si des neurones en culture représentent fidèlement la situation in vivo ou si le recrutement ARNm est une réponse adaptative des axones à conditions de culture est toujours ouverte. Peu d&#39;études ont fourni des preuves de recrutement d&#39;ARNm de mûrir axones in vivo. Par exemple, la transcription codant pour la protéine de marquage olfactif a été détectée dans les axones des neurones sensoriels adultes 22. Un transgène contenant l&#39;extrémité 3 &#39;UTR de l&#39;ARNm de β-actine est transporté vers les axones des neurones du système nerveux central et périphérique chez des souris et se traduit localement après 23 périodes de développement. Lamin de l&#39;ARNm est localisée aux axones de la rétine dans Xenopues laevis têtards et son épuisement affecte l&#39;entretien de l&#39;axone après le développement des axones 21. Interférence avec le transport axonal de l&#39;ARNm codant pour la cytochrome C oxydase IV modifie le comportement de la souris 24. Enfin, ATF4 ARNm se trouve dans un adulteXons des souris et des cerveaux humains dans le contexte de Aß 1-42 induite par la neurodégénérescence 18. Analyses du transcriptome à haut débit se sont avérées utiles pour identifier les profils d&#39;ARNm dans les axones isolés in vitro, mais avoir des limites pour des études in vivo depuis dans les tissus entiers axones ne se trouvent jamais dans l&#39;isolement, mais entremêlées avec les organes de cellules neuronales, cellules gliales et d&#39;autres types de cellules. Ainsi, de telles analyses doivent être combinées avec des techniques d&#39;imagerie qui confirment la localisation subcellulaire des ARNm. Hybridation in situ de l&#39;ARN (ARN ISH) en permet la détection et la visualisation des séquences d&#39;ARN spécifiques dans les cellules et les tissus. Cependant, les tests ARN ISH originaux étaient conviennent que pour l&#39;identification des ARN très abondantes 25, ce qui est rarement le cas pour les ARNm axonaux localisées. Pour les dernières décennies des efforts accrus ont été mis en développant de nouvelles technologies qui permettent la détection des ARNm au niveau d&#39;une seule molécule <sup&gt; 25,26. Par exemple, Singer et ses collègues ont mis au point des sondes ISH pour détecter des ARNm dans des cellules individuelles, consistant à 5 non-chevauchement marqué par fluorescence 50-mères (pour plus de détails se réfèrent à 27). La principale différence entre les techniques mentionnées ci-dessus et celle décrite ici est que le plus tard, utilise 20 à double Z-structure (pas linéaire) sondes qui ciblent typiquement ~ 1 kb région de l&#39;ARN d&#39;intérêt assurant la spécificité et faible niveau de fond. Les sondes sont ensuite hybridées avec préamplificateur et l&#39;amplificateur des séquences qui sont finalement marqué par fluorescence ou conjugués avec des enzymes qui permettent des réactions chromogènes. Ces étapes d&#39;amplification d&#39;améliorer le rapport signal-bruit par rapport à d&#39;autres technologies de ISH 28. Nous décrivons ici deux protocoles utilisant RNAscope associée, soit à fluorescence immunocytochimie ou avec des colorants histologiques permettant contre-coloration axonale. Les deux protocoles sont appropriés pour visualiser la localisation axonale des ATF4 ARNm dans mo adultesutiliser et les cerveaux humains.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control probe-DapB</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310043</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">312471</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-human PPIB (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">313901</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">320850</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310035</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>KTLFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold mounting&#160; medium with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

ARNm sont souvent localisées aux axones vertébrés et leur traduction locale est nécessaire pour pathfinding axone ou de branchement pendant le développement et pour l&#39;entretien, la réparation ou la neurodégénérescence dans les périodes postdevelopmental. Analyses à haut débit ont récemment révélé que les axones ont un transcriptome plus dynamique et plus complexe que prévu. Ces analyses, mais ont été principalement fait dans des neurones en culture, où les axones peuvent être isolées à partir des compartiments de somato-dendritique. Il est pratiquement impossible de réaliser une telle isolation dans les tissus entiers in vivo. Ainsi, afin de vérifier le recrutement d&#39;ARNm et leur pertinence fonctionnelle dans un animal entier, les analyses de transcriptome devraient idéalement être combinées avec des techniques qui permettent la visualisation des ARNm in situ. Récemment, de nouvelles technologies de l&#39;ISH qui détectent ARN au niveau d&#39;une seule molécule ont été développés. Ceci est particulièrement important lors de l&#39;analyse de la localisation subcellulaire de l&#39;ARNm, ARN depuis localisées se trouvent généralement à des niveaux faibles. Nous décrivons ici deux protocoles pour la détection des ARNm axonaux-localisées en utilisant une technologie ultrasensible nouvel ARN ISH. Nous avons combiné RNAscope ISH avec de contraste axonale par immunohistochimie de fluorescence ou des colorants histologiques de vérifier le recrutement de ATF4 ARNm aux axones in vivo chez la souris adulte et les cerveaux humains.

Un bref résumé des procédures décrites ci-dessus est représentée sur la figure 1. Détection optimale des ATF4 ARNm granules dans les axones cholinergiques utilisant démasquage induite par la chaleur Lors de l&#39;évaluation localisation axonale des ARNm, il est essentiel de pouvoir identifier les axones et d&#39;être en mesure de visualiser faibles ARN abondantes. La technologie de l&#39;ARN ISH décrit ici permet la détection...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization at JoVE.com

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Recherche

Neurosciences

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combinant colorant lipophile, In situ</emHybridation>, immunohistochimie et l&#39;histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Une approche rapide à l&#39;imagerie de fluorescence à haute résolution dans les tranches de cerveau semi-épais

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Détection du génome et des transcriptions d&#39;un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L&#39;hybridation combinée avec immunocoloration

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans des larves de la lamproie marine

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Haute résolution<em&gt; In Vivo</em&gt; Protocole de segmentation manuelle pour les sous-zones de l&#39;hippocampe humain Utilisation 3T imagerie par résonance magnétique

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Rapid<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation utilisant sondes oligonucléotidiques sur Brain Paraformaldéhyde préfixée de rats avec syndrome sérotoninergique

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification de la Dopamine D1-Alpha du récepteur au sein de rongeurs noyau Accumbens par une ARN innovantes In Situ la technologie de détection

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Imagerie 3D haute résolution de l'infection par le virus de la rage dans un tissu cérébral éclairci par solvant

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...