Name: derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into expandable neural progenitor cells
Uploaded: 2015-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить всех членов Stem Cell и регенеративной медицины группы университета Вюрцбурга за полезные предложения и Мартина Гебхардт, а также Хайке Arthen за отличную техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами от Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), немецкого министерства образования и научных исследований BMBF (01 GN 0813), баварский исследовательской сети индуцированных плюрипотентных стволовых клеток &quot;forIPS&quot; и &quot;Stiftung Sibylle Ассмуса &quot;. На рисунке 1 было получено с использованием Servier Medical Art, доступные из www.servier.com.

Человеческие фибробласты, используемые в этом исследовании, были получены от удара кожа биопсии после получения информированного согласия и разрешение этического комитетом по этике Университета Вюрцбурга, Германия (этический доклад не: 96/11 от 10.06.2011). 1. Удар биопсии <ol>...

Здесь мы показываем, изоляцию и прямое преобразование фибробластов человека в расширяемых трансгенных клеток, свободных нервной предшественников и их дифференцированное потомство как предполагаемого основе для сотового-заместительной терапии или применения в скрининге лекарствен...

В 2006 году Яманака и его коллеги смогли показать, впервые возможность перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентных государства 1. Это дедифференцировка было достигнуто гиперэкспрессией четырех факторов транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и C-Мус в мышиных фибробластов. Сформированные так называемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) показывают функциональную эквивалентность эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и, таким образом, могут быть дифференцированы во все типы клеток взрослого организма. Один год спустя перепрограммирования для ИПСК также может быть достигнуто за фибробластов человека 2. Эксперименты на животных моделях показывают, что Ipsc-клеток, полученных как правило, могут быть использованы для клеточной терапии замены, например, в болезни Паркинсона (PD) 3-5. Тем не менее, некоторые ограничения, связанные с использованием ИПСК представляют препятствия для полной реализации их терапевтического потенциала. Прежде всего, перепрограммирования клеток в плюрипотентные состоянии и последующееКонтроль качества, как правило, отнимает много времени и неэффективный процесс уступая в обширных и, таким образом, дорогостоящие процедуры для культивирования клеток. Во-вторых, иПСК должны быть повторно дифференцировать в нужный тип клеток, представляющих интерес до биомедицинского применени, и вероятность остаточных клеток плюрипотентных в дифференцированной популяции таит значительную онкогенного потенциала и, таким образом, показывает высокий риск после трансплантации клеток 6. В-третьих, процесс перепрограммирования, как правило, достигается путем индукции факторы перепрограммирования lenti- или ретровирусной инфекции. Интеграция этих вирусов в геном хозяина, может привести к инсерционного мутагенеза и / или неконтролируемого реактивации трансгенов 7,8. Номера интегративные системы были разработаны для обеспечения факторы перепрограммирования в клетки-мишени, которые минимизируют риск инсерционного мутагенеза и трансгенной реактивации. Примерами таких трансгенных свободной подходов перепрограммирование клеток с использованием не-интеграцииАдено или вирус Сендай 9,10 векторы на основе ДНК 11 или применение методов ДНК-бесплатно, как трансфекции синтетического мРНК 12 или трансдукции рекомбинантных белков 13,14. Другой перспективный метод для вывода трансгенной свободной IPSC является использование LoxP модифицированный лентивирусный перепрограммирования конструкций и последующего удаления трансгенов, используя систему 15,16 рекомбинации Cre-LoxP ДНК. Более простой подход к генерации нервных клеток для клеточной терапии замены представляет собой прямое преобразование фибробластов в постмитотических нейронов 17-20. Vierbuchen др. Сообщили, что избыточная экспрессия транскрипционных факторов Ascl1, Brn2 и Myt1l результаты в поколение 20% нейронов из мышиных фибробластов 17. В 2011 году было показано, что этот же три фактора транскрипции в сочетании с гиперэкспрессией NeuroD1 включить трансдифференцировки фибробластов человека в NeuРОНС 19. Нейроны человека индуцированных может также быть получены путем избыточной экспрессии Ascl1 и Ngn2 под двойной SMAD- и GSK3β- торможения 20. Примечательно, прямое преобразование фибробластов в нейроны генерирует непролиферативная, постмитотические клеточной популяции, которые не позволяют дальнейшее расширение и Biobanking. Недавно прямого преобразования фибробластов в пролиферации клеточной популяции нейронных стволовых / клеток-предшественников сообщается 21-26. Для ясности, все эти типы клеток будет называться индуцированных нервных клеток-предшественников (iNPCs) в этом докладе. Хан и др. Сверхэкспрессируется Brn4, Sox2, с-Мус и Klf4 генерировать iNPCs. Как и их коллеги нервных стволовых клеток, полученных из тканей либо основной или плюрипотентных клеток эти iNPCs являются tripotential и может быть дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты 21. Наша группа сообщила немного другой протокол преобразования участием сверхэкспрессию Sox2, Klf4И с-Myc и Oct4 индуцированных выражение только 5 дней. При таком подходе мы могли бы генерировать стабильно пролиферирующих iNPCs из мышиных эмбриональных и взрослых фибробластов, которые обладают полной молчание перепрограммирование факторы 22. В отличие от ИПСК, iNPCs не проявляют онкогенного потенциала после трансплантации 27. Мы успешно использоваться превращают клетки в животной модели демиелинизации миелиновых, дефицитных крыс, демонстрируя, что iNPCs клинически полезны 22. До тех пор, пока НПС может быть генерируется только из плюрипотентных стволовых клеток или первичной нервной ткани 28-32. iNPCs стабильно расширяемая клетки, которые могут быть криоконсервированных и способны дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Много усилий было сделано, чтобы адаптировать прямой протокол преобразования из мыши с клетками человека 23,26,33,34. В 2012 году она была опубликована, что избыточная экспрессия одного фактора Sox2 в фибробластах достаточно для создания мышиных и человеческих iNPCs <sдо 33&gt;. Авторы сообщили поколение человека из эмбриональных iNPCs крайней плоти фибробластов и характеризуется их окрашиванием против Sox2 и нестин. Тем не менее, клетки-мишени, используемые для перепрограммирования представляют собой очень специфический тип клеток, которые не будут доступны в клинической практике, и не было никакой функциональной характеристики преобразованных клеток трансплантации в животной модели выполнена. Более недавняя публикация описывает генерацию нервных клеток-предшественников из ограниченных фетальных фибробластов человека избыточной экспрессией Sox2, с-Мус и либо Brn2 или Brn4 34. Сформированные клеточные линии показали самообновлению мощности и может быть дифференцированы в различные типы терминалов нейронов. Тем не менее, использование эмбриональных фибробластов является неблагоприятным, так как эти клетки являются гетерогенной происхождения и никто не может исключить наличие остаточной например, нервного гребня стволовых клеток в препаратах. В 2014 году Чжу и др. Сообщили прямое преобразование взрослого человека и неоНатальные фибробластов в tripotential нейронных клеток-предшественников сверхэкспрессией Sox2 вместе с Oct4 или Oct4 в покое и добавлением небольших молекул в клеточной культуральной среде. Следует отметить, что на основе их исследования Sox2 было недостаточно, чтобы вызвать прямое преобразование 26. Совсем недавно, Лу и др. Сообщили, что избыточная экспрессия Яманака факторы Oct4-, Sox2-, Klf4-, с-Мус вирусом Сендай в течение 24 ч и последующей инактивацией вируса увеличением температуры приводит к генерации расширяемой tripotential нервной клетки-предшественники 23. В заключение, хотя протоколы преобразования опубликованных для человеческих клеток до сих пор имеют в общем сверхэкспрессии по меньшей мере одного или более факторов YAMANAKA, часто в своевременной ограниченным образом, нет четкое указание минимальных молекулярных факторов, необходимых для управления прямой преобразование в iNPCs. Своевременно ограничено избыточная экспрессия Oct4 либо путем генетических средств, трансфекции с синтетическим мРНК, или сELL проникающий белок вместе с конститутивной экспрессии Sox2, КФК-4 и С-Мус не приводят к стабильным человека линий INPC еще. Таким образом, применение вируса Сендай для сверхэкспрессии все факторы YAMANAKA и своевременно ограничить свою активность путем термической инактивации вируса 23 вместе с оптимизированных условиях нейронной медиа индукционных 22,31 представляет собой предпочтительный стратегии до сих пор. Несколько исследований показывают, сотовый функциональность НСК или их дифференцированных коллегами в различных моделях болезни животных. Нервные клетки-предшественники из человеческих плюрипотентных стволовых клеток были пересажены в мышиных моделях заболевания нейровоспалительных склероза 35,36. Применимость чЭСК полученных нервных клеток-предшественников в EAE (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) -mice был впервые показан в 2008 году 35. Мультипотентные нервные клетки-предшественники вводили в желудочки мозга мыши, и результат трансплантацииред в уменьшении клинических признаков ЭАЭ. Ким и др. Генерируются олигодендроглиальным прекурсоров из ЭСК и пересадить тех интрацеребровентрикулярно в EAE-мышей. Хотя пересадка не проживет больше 10 дней, мышей показали значительное улучшение неврологической функции и снижение провоспалительных иммунных клеток в белом веществе 36. Стволовые клеточной терапии применяется также для доклинического адресности болезни Паркинсона, как НПС может быть успешно применен в соответствующих моделях животных. Для этого клетки-предшественники были либо получены из эмбриональной ткани головного мозга 37 дифференцированной из плюрипотентных стволовых клеток или 38-40 мезенхимальных стволовых клеток 41 были использованы. В 2012 году мы показали, что мыши iNPCs способны производить протеолипидного белок, основной компонент миелина белок, после трансплантации в мозг миелин-дефицитных (MD) крыс 22. К этому доказательством правильности принципа эксперимента терапевтический applicabilность iNPCs был, во-первых доказано, и вскоре подтвердил и в другом исследовании 32. Тем не менее, весь потенциал терапевтического использования человеческих iNPCs остается изучить. Здесь мы показывают надежную и комплексного процесса (I) выводе человека из первичных клеток взрослых пациентов через биопсии кожи, (II) прямое преобразование фибробластов человека в состоянии нервной предшественников и (III) способность iNPCs быть дифференцированы в нейрональный и глиальные линий. Использование этого протокола позволит ускорить генерацию аутологичных клеток человека для терапевтического применения.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Astrocyte media</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td align="right">1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>pfm medical</td>
			<td align="right">48301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon medchem</td>
			<td align="right">1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type2</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>PAN&#160;</td>
			<td>P10-032100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Roth</td>
			<td align="right">4720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td align="right">50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP-antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hLIF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>GEM-700-112-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67-antibody</td>
			<td>NeoMarkers</td>
			<td>RM-9106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSC freezing media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct4-antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>inh-sb43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>&#160;LifeTechnologies</td>
			<td>A1378001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumpyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox1-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-205725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 146986-50-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into expandable neural progenitor cells

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из взрослых фибробластов кожи и последующего дифференцировке в соматических клетках обеспечивает увлекательные перспективы вывода аутологичных трансплантаций, что обойти гистосовместимости барьеры. Тем не менее, прогресс через состояние плюрипотентных и последующей полной дифференцировки в желаемые линий остается препятствием для клинического перевод технологии IPSC из-за связанных опухолевого потенциала и геномной нестабильности. В последнее время мы и другие показали, что соматические клетки не могут быть преобразованы только в ИПСК, но и в разных типах соматических мультипотентными стволовых клеток с помощью определенных факторов, таким образом, обходя прогрессирование через плюрипотентных государства. В частности, прямое преобразование человеческих фибробластов в индуцированные нервные клетки-предшественники (iNPCs) предвещает возможность нового источника аутологичных клеток для различных применений, таких как замена клеток, заболевания моделированияи скрининг лекарств. Здесь мы опишем изоляции взрослого человека первичных фибробластов по биопсии кожи и их эффективного прямого преобразования в iNPCs своевременной ограниченной экспрессии Oct4, Sox2, Klf4, а также с-Мус. Sox2-положительных нейроэпителиальные колонии появляются после 17 дней индукции и INPC линии могут быть установлены эффективно моноклональных изоляции и расширения. Точная регулировка вирусной множественности инфекции и добавок ингибирующий лейкоз фактор во время фазы индукции представляют критические факторы для достижения эффективности преобразования до 0,2%. До сих пор, конкретного пациента INPC линии может быть расширен более чем на 12 проходов и равномерно отображения морфологические и молекулярные особенности нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников, таких как выражения нестин и Sox2. Линии INPC могут быть дифференцированы в нейроны и астроциты, о чем судили путем окрашивания против TUJ1 и GFAP, соответственно. В заключение, мы сообщают надежные протокол для вывода и тяжелаяПреобразование КТ фибробластов человека в стабильно расширяющихся нейронных клеток-предшественников, которые могли бы обеспечить сотовой источник биомедицинских приложений, таких как аутологичных клеток нервной замены и моделирования заболевания.

Здесь мы представляем описание интегрированного процесса, что позволяет поколение индуцированных нервных клеток-предшественников (iNPCs) из фибробластов человека, которые были получены с помощью биопсии удар с кожи в течение менее чем 8 недель (рис 1). Пациент-iNPCs, специфические ?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells at JoVE.com

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки обеспечивает увлекательные перспективы вывода аутологичных трансплантаций. Тем не менее, прогресс через состояние плюрипотентных и кропотливой повторного дифференцирования еще мешает клиническую перевод. Здесь мы опишем вывод взрослых фибробластов человека и их прямое преобразование в индуцированных клеток нервной предшественников и последующего дифференциации в нейронных линий.

Вывод для взрослых фибробластов человека и их прямое преобразование в расширения нейронной клетки-предшественники

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Покадровый Живая съемка клонально Связанные нейронные клетки-предшественники в развивающихся данио рерио переднего мозга

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-колония Формирование анализа клеточной: Пробирной различать Добросовестный нервные стволовые клетки из нервных клеток-предшественников

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-перепрограммирование перицитов клеток, полученных из взрослых мозга человека в индуцированные нейронов

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Сотовый Сортировка нейронных стволовых и прогениторных клеток из взрослых мышей субвентрикулярной зоны и Live-визуализация клеточного цикла динамика

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Разработка изысканный протокола для транс склеры субретинальное трансплантации эпителиальных клеток человека пигмента сетчатки глаза крыс

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic трансплантация межнейронного прекурсоров в раннем постнатальном мыши мозги

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Определение клеточных поверхностных маркеров первичных нейронных стволовых и клеток-прародителей путем метаболической маркировки сиалогликан

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Преобразование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в функциональные спинномозговых и черепных двигательных нейронов с помощью переносчиков

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...