Name: application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle
Uploaded: 2015-07-11T13:00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Long-term cultured Interferon-ÃŽÂ³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle at JoVE.com

وأيد البحث من قبل وزارة الزراعة، ARS كريس: 3625-32000-104 والزراعة ومبادرة بحوث الأغذية تنافسي منحة لا. 2011-67015-30736 من المعهد الوطني USDA للأغذية والزراعة. نشكر جيسيكا بولوك، إيما Frimml مورغان، شيلي زيمرمان، كريستين باس، بروس PESCH، مولي Stafne، ألن جنسن، وتريسي بورتر للحصول على مساعدة فنية ممتازة وكذلك ريبيكا ماديسون، دوغ يوينغ، كاتي Pille، جاي ستيفن، ديفيد لوبرز روبن Zeisness، وديفيد Panthen لرعاية ممتازة والتعامل مع الحيوانات.

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

هو إنتاج IFN-γ في المدى الطويل المقايسات ELISPOT مثقف يرجع عموما إلى الطب الصينى التقليدى في البشر، ولكن كيف تطور هذا الرد في ثقافة غير مفهومة. سواء الطب الصينى التقليدى موجودة في الدورة الدموية والتوسع في المختبر، أو إذا كانت ردود الطب الصينى التقليدى تنتج عن تمايز الخلايا المستجيب وتيم في الطب الصينى التقليدى خلال الثقافة غير معروف. ومع ذلك، فقد وجدت الدراسات مع عينات من البشر أن خلايا CD4 + T من خارج الحي وطويلة الأجل فحوصات مثقف IFN-γ ELISPOT لها خصوصيات حاتمة لا علاقة لها، مما يعني أن ردود الطب الصينى التقليدى لا تتطور من الخلايا المستجيب 28. من الواضح، ومدة الاستجابة قد تختلف، ولكن إذا ويتحقق إزالة العوامل المسببة للأمراض، في نهاية المطاف على حد سواء خارج الحي وردود الطب الصينى التقليدى تنخفض. أيضا، ردود الثقافات على المدى الطويل قياسها في وقت مبكر وبعد فترة طويلة من فتيلة الأنتيجين (عند الاستجابة المستجيب أقل) يظهر لربط، مشيرا إلى أن تعميم السكان الطب الصينى التقليدى وقت مبكر، وبعد فترة طويلة المضادةلا يزال فتيلة الجيني ذات الصلة في الجسم الحي. من ناحية أخرى، لا يظهر حجم الاستجابة فيفو السابقين لتكون متصلة بحجم الرد الذاكرة 29. هذه النتائج تشير إلى أن المثقف-γ IFN الردود ELISPOT طويلة الأجل ناتجة عن التوسع في المختبر من الطب الصينى التقليدى وانحسار المرتبطة الردود المستجيب في العينة، بدلا من تمايز الخلايا المستجيب في الطب الصينى التقليدى النمط الظاهري. مع الماشية، والمساهمة النسبية للالمستجيب والذاكرة فرعية لردود الكشف عنها بواسطة طويلة الأجل فحوصات IFN-γ ELISPOT غير معروف. وتشير الدراسات الحديثة وجود علاقة بين لقاح أثارت مثقف-γ IFN الردود ELISPOT على المدى الطويل وحماية ضد العدوى التجريبية لاحق مع M. البقرية 23-24. وقد أفيد أن ضعف على المدى الطويل IFN-γ الردود ELISPOT لتطعيم ترتبط مع عدم وجود حماية 30. كل من يعيش وقتلاللقاحات إد تحفز مماثلة خارج الحي IFN-γ الردود ELISPOT، ولكن التطعيم الحية BCG يتسبب على المدى الطويل مثقف-γ IFN ELISPOT ردود فعل أقوى من الاستعدادات لقاح للقتل. ومن المثير للاهتمام، واللقاحات الحية واقية في حين فشلت تركيبات قتل لتوفير الحماية من التحدي مع ضراوة المتفطرات السلية 31-32، 33. تقييم ردود الطب الصينى التقليدى هو أيضا ممكنا عن طريق فرز هذه الخلايا من PBMC. تخصيب المباشر من الطب الصيني التقليدي من PBMC، ومع ذلك، يتطلب أجهزة غالية الثمن، المدربين تدريبا عاليا الشخصية وصعب لأن هذه الخلايا ليست عديدة في مجرى الدم. توفر ثقافة طويلة الأمد من PBMC إثراء الطب الصينى التقليدى على تيم والخلايا المستجيب دون أجهزة باهظة الثمن. ومع ذلك، ليتم توسيع هؤلاء السكان الخلايا التائية في المختبر أنها قد تكون أقل تمثيلا من الردود الذاكرة في الجسم الحي. فمن الممكن للوصول إلى استجابات ذاكرة IFN-γ (باستخدام الثقافة على المدى الطويل أو الطب الصينى التقليدى النوعELISAs خلوى 34، صفائف خلوى حبة (CBA)، وتلطيخ الخلايا (ICS)، أو صفائف بروتين السيتوكين (CPA): استراتيجيات) من خلال فحوصات أخرى من ELISPOT مثل جي. هذه الأساليب؛ ومع ذلك، عادة ما تكون أقل حساسية من ELISPOT المقايسات 35. ميزة من ELISPOT هو قدرته على كشف القبض الفوري للخلوى بعد وقت قصير من إطلاقه منع التخفيف في طاف والتدهور التي كتبها الانقسام الأنزيمية أو امتصاص خلوى بواسطة خلايا أخرى. المقايسات ELISPOT كشف الخلايا وحيدة إنتاج السيتوكينات تقديم نتائج دقيقة حتى في إشارة إلى انخفاض سيناريوهات الضوضاء (أي استجابات محددة منخفضة) 35. أيضا، مع ICS، والكشف عن السيتوكينات قبل الإفراج قد يؤدي إلى هوية مزورة من الخلايا المنتجة السيتوكينات (على سبيل المثال، وذلك بسبب تعديل آخر متعدية قبل أو أثناء عملية إفرازية) 34. مثبطات النقل المستخدمة مع ICS المقايسات لتقليل إفراز السيتوكيناتخلال التحفيز مستضد (المعروف باسم جولجي البروتينات توقف) تحديد مدة التحفيز الخلية نظرا لسمية خلية من هذه البروتينات التي تؤثر في نهاية المطاف إنتاج السيتوكينات 35. مع أن قال - CBA، CPA وICS تقنيات مفيدة لقياس السيتوكينات متعددة في وقت واحد و / أو لتحديد سطح الخلية علامة التعبير (أي مع ICS). وبالتالي، يمكن استخدام هذه الأساليب في تركيبة مع-γ IFN ELISPOT مقايسة 36. في حين السل البقري الدراسات نجاعة اللقاح السابقة قياس ردود الطب الصينى التقليدى عبر ELISPOT مقايسة، فإن الكشف عن ردود الطب الصينى التقليدى من خلال تقنيات أخرى على الأرجح تسفر عن نتائج مماثلة. الأهم من ذلك، مقايسة ELISPOT أقل تكلفة وأبسط لأداء من CBA، CPA وتحليل ICS تقنيات 34. العد والفرز اليدوي من SFC هو بديل لالعد الآلي، ويمكن تخزين لوحات ELISPOT في RT لفترة طويلة من الوقت مع الحد الأدنى من فقدان جودة، قبل أو بعد بقعة جounting 37. وقد تم تطبيق على المدى الطويل مثقف-γ IFN ELISPOT استجابة لتقييم الاستجابات الذاكرة من قبل الإنسان، والماشية عند تقييم الاستجابات لقاح السل 14-16،31-32،33. ويفترض ردود TCM أيضا أن تلعب أدوارا هامة في ردود المضيفة لعدة عوامل المعدية الأخرى من الماشية، مثل: الميكوبلازما الفطرانية subsp الفطرانية 42، Anaplasma هامشية 38 و البقري الفيروس المخلوي التنفسي 39. يحتمل أن تكون، يمكن تكييف ELISPOT مقايسة طويلة الأجل لغيرها من الحيوانات الأنواع، والسيتوكينات والالتهابات. وهذه التطبيقات الأوسع يكون مفيدا بشكل خاص للتطبيقات علم المناعة البيطرية بسبب محدودية الحالي من الكواشف محددة. ردود TCM حاسمة للوقاية من العديد من الأمراض، ولكن قياس عليها في وقت مبكر بعد الاصابة / التحصين (للتنبؤ نتيجة مرض أو نجاعة اللقاح) أماهذ تكون مرهقة. وتحليل الاستجابة المناعية تحت خارج الحي والشروط التحفيز المستضدات قصيرة في كثير من الأحيان تمثل ردود المستجيب، وذلك بسبب التداخل الردود الذاكرة والمستجيب، وخصوصا خلال بداية تكوين الذاكرة المناعية. في سياق الأمراض المزمنة التي الحمل المستضد هو مستمر، وخارج الحي الردود تقييم استجابات الخلايا المستجيب أو مزيج من الردود الذاكرة والخلايا المستجيب. على المدى الطويل مثقف-γ IFN ELISPOT الفحص، الموصوفة هنا، من المرجح أن تمكن من قياس ردود الطب الصينى التقليدى بدلا من الخلايا T المستجيب أو الجمع بين استجابات الخلايا CD4 + T. باختصار، يوفر على المدى الطويل مثقف-γ IFN ELISPOT مقايسة نهجا قيما لتقدير T الردود ذاكرة الخلية واستخدمت بنجاح لتقييم ردود ذكرى العديد من الأنواع لمجموعة متنوعة من عوامل العدوى 12-16، 20-25،29 ، 31،33،34،38،39.

يتم إنشاء خلايا المستجيب والذاكرة T من خلال برمجة التنموية للخلايا CD4 + T ساذجة بعد الاعتراف مستضد. تمايز الخلايا الساذجة CD4 + T إلى خلايا خلوى إنتاج يتطلب الاعتراف الممرض من قبل الخلايا المناعية الفطرية، تقديم المستضد للخلايا T، وشارك في التحفيز والتغيرات النسخي مما أدى إلى إنتاج السيتوكينات الاستقطاب. على سبيل المثال: خلايا مقدمة للمستضد تنتج انترلوكين (IL) -12 ردا على مسببات الأمراض داخل الخلايا، التي، جنبا إلى جنب مع الاعتراف مستضد، ويعزز التمايز للخلايا T في T المساعد 1 (TH1) خلايا 1،2 خلال الإشارة من خلال محول الإشارات ومنشط النسخ 4 (STAT4) وT-مربع أعرب في خلايا T (T-رهان)، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا، IL-2 الإنتاج، والتوسع نسيلي ومضاد للفيروسات (IFN) إنتاج -γ 3،4. إذا يتم التحكم في العدوى، ويتم استبعاد ما يصل إلى 95٪ من الخلايا T ولدت خلال مرحلة التوسع (أي انكماشلا تزال مرحلة) وذاكرة الخلايا التائية، وأحيانا لمدى الحياة 5. Sallusto وآخرون 6، كشف مجموعتين فرعيتين متميزة وظيفيا من الخلايا التائية الذاكرة لدى البشر على أساس التعبير عن مستقبلات صاروخ موجه العقدة الليمفاوية. الخلايا التائية الذاكرة المركزية (TCM) تعبر عن مستقبلات chemokine CC (CCR) -7 وCD45RO وتقع أساسا في مناطق T-خلية من الأجهزة اللمفاوية الثانوية. TCM محدودة وظيفة المستجيب، عتبة تفعيل المنخفضة والاحتفاظ ارتفاع إنتاج IL-2 والقدرة التكاثري. خلايا الذاكرة المستجيب T (تيم) تعبر عن CD45RO، تفتقر CCR7 وعرض مستقبلات لصاروخ موجه إلى الأنسجة الطرفية أو الملتهبة. خلايا المستجيب لا تعبر عن أي CCR7 أو CD45RO لكن فورا إنتاج السيتوكينات المستجيب، مثل IFN-γ، عند الاعتراف مستضد. يتم استخدام فحوصات الإفراج IFN-γ (اجرا) لتشخيص السل البقري والبشري 7. المتفطرة البقرية هو العامل الرئيسي لمرض السل البقري (BTB)، في حين كاليفورنيا الإنسانهي سبب سيس من السل بشكل رئيسي من قبل المتفطرة السلية. مع هذه الاختبارات، والدم كله أو الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMC) وحفز مع المستضدات المتفطرات من 16 إلى 24 ساعة والإنتاج IFN-γ داخل طاف يقاس ELISA أو من خلال الكشف عن الخلايا المنتجة IFN-γ باستخدام تقنيات ELISPOT. ونتيجة لفترة وجيزة التحفيز (أي، من 16 إلى 24 ساعة)، وإنتاج السيتوكينات السريع، خارج الحي فحوصات الكشف في المقام الأول المستجيب وتيم الردود. وقد تأكد ذلك من خلال تحليل تدفق cytometric من السكان الخلية في هذه الثقافات 10/08. السابق مدرجة الجسم الحي استجابات IFN γ بشكل روتيني في تقييم وحة الاستجابة المناعية للقاحات السل، بما في ذلك تلك المستخدمة لتقييم ردود الماشية. معظم لقاحات فعالة السل البقري تثير استجابات IFN γ محددة، ولكن ليس جميع اللقاحات التي تحفز استجابات IFN γ هي protectivه. أيضا، ومستويات IFN-γ التي تسببها التطعيم، كما تم قياسها قبل الإصابة، لا ترتبط بالضرورة مع الحماية. على سبيل المثال، قد يكون سلالات مختلفة BCG قدرات مختلفة للحث خارج الجسم الحي استجابة IFN-γ، على الرغم من مستويات حماية مماثلة (11). وبالتالي، خارج الحي IGRAs هي قيمة لتشخيص السل وللوصول المناعية اللقاحات؛ ومع ذلك، فإن استخدامها في التنبؤ نجاعة اللقاح محدودة. ردود الطب الصينى التقليدى لتلقيح، من ناحية أخرى، يمكن أن تستخدم للتنبؤ نجاعة اللقاح، كما هو موضح مع فيروس نقص المناعة القردي (SIV) إصابة في الرئيسيات غير البشرية 12،13، والسل في الفئران 14 والملاريا في البشر 15،16. بعد استجابة مناعية فعالة مما يؤدي إلى إزالة العوامل المسببة للأمراض، ويحتفظ الطب الصينى التقليدى وتوفير الحماية للعدوى الثاني في نهاية المطاف من قبل نفس الوكيل. وهناك استثناء واضح من هذا السيناريو هو M. infe السلction من البشر التي المرضى الذين يتلقون العلاجية العلاج المضاد للالفطرية عرضة لإعادة العدوى 17،18. بالإضافة إلى ذلك، والأحداث التي تنظم الذاكرة المناعية أثناء الالتهابات المزمنة، حيث استمر التحفيز الأنتيجين، ليست مفهومة جيدا 19. أثناء الالتهابات المزمنة، مثل المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) والسل، ويرتبط استجابة كبيرة الطب الصينى التقليدى مع نتيجة إيجابية (مثل الكمون مع السل ومرض تحت الإكلينيكي مع فيروس نقص المناعة البشرية) 20،21. وقد أثبتت العديد من الدراسات على الفئران والبشر أن على المدى الطويل مثقف المقايسات ELISPOT-IFN γ تقيس ردود الطب الصينى التقليدى 16،20-22. مع هذا الاختبار، PBMCs هي مثقف في خفض تركيز المستضد لمدة 10 إلى 14 يوما، والسماح ردود المستجيب إلى ذروته ويضعف. تسهيل الطب الصينى التقليدى للتمييز، وتوسيع إطار الثقافة. كما تم استخدام على المدى الطويل مثقف IFN-γ المقايسات ELISPOT في الطب البيطري.وكانت الأبحاث، إلا أن النمط الظاهري للخلايا الاستجابة الصعب تقدير نظرا لعدم وجود الكواشف الحيوية، وخاصة أجسام مضادة لCCR7. لقاحات السل البقري فعالة [على سبيل المثال. باستخدام جرعة واحدة من M. البقرية عصيات كالميت غيران (BCG)، تليها BCG التي كتبها مستضد 85A قاح الوحيدات الفيروسية تنقلها، أو الموهن M. البقرية ΔRD1] انتزاع مثقف-γ IFN الردود ELISPOT على المدى الطويل بعد التطعيم التي ترتبط مع حماية (أي أقل عبء الفطرية وانخفاض علم الأمراض المرتبطة TB) ضد التحدي لاحق مع ضراوة M. البقرية 23،24. وعلاوة على ذلك، فإن أعداد خلايا إفراز الإنترفيرون γ-مستضد معين داخل الثقافات PBMC على المدى الطويل هي أعلى في 12 شهرا ولكن انخفاض في 24 شهرا بعد التطعيم BCG العجول حديثي الولادة، ربط مع درجة من الحماية آخر كشف M. البقرية تحديا 25. في هذا السيناريو، مثقف IFN-γ ELISPOT هوأداة ن هامة للتنبؤ نجاعة اللقاح، وتوفير وسيلة لإعطاء الأولوية لقاحات مرشحة للمحاكمات فعالية التكلفة العالية. بالإضافة إلى ذلك، تقنيات ELISPOT مثقف يمكن تكييفها لمختلف المضيفين، مسببات الأمراض والسيتوكينات عن طريق تغيير المستضدات أو الأجسام المضادة لمجموعة متنوعة من الأغراض في المجالات البحثية المختلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sodium citrate (dihydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citric acid (monohydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dextrose</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT PVDF plate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC &#8211; AP KIT Standard</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>AK-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag85A</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0004.3</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB 10.4</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0061.6</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPDb</td>
			<td>Prionics AG</td>
			<td>7600055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rESAT-6:CFP10</td>
			<td>Kind gift Dr. Minion, Iastate</td>
			<td></td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783B</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Biotinylated Clone CC330</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2112</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1653GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2434GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-human CCR7 Clone 3D12</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947;-Pe Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7</td>
			<td>SouthernBiotechnology</td>
			<td>1080-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm&#8482;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrefeldinA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed Mitogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat human Interleukin 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle

يتم إنشاء خلايا المستجيب والذاكرة T من خلال برمجة التنموية للخلايا ساذجة بعد الاعتراف مستضد. إذا يتم التحكم في العدوى تصل إلى 95٪ من الخلايا T ولدت خلال مرحلة التوسع والقضاء عليها (أي مرحلة الانكماش) ​​والخلايا التائية الذاكرة لا تزال قائمة، وأحيانا لمدى الحياة. في البشر، وقد وصفت اثنين من مجموعات فرعية متميزة وظيفيا من ذاكرة الخلايا التائية على أساس التعبير عن مستقبلات صاروخ موجه العقدة الليمفاوية. خلايا T الذاكرة المركزية تعبر عن CC مستقبلات chemokine 7 وCD45RO وتقع أساسا في مناطق T-خلية من الأجهزة اللمفاوية الثانوية. خلايا T الذاكرة المستجيب تعبر عن CD45RO، تفتقر CCR7 وعرض مستقبلات المرتبطة اللمفاوية صاروخ موجه إلى الأنسجة الطرفية أو ملتهبة. خلايا T المستجيب لا تعبر عن أي CCR7 أو CD45RO ولكن عند لقاء مع السيتوكينات المستجيب المنتجات مستضد، مثل انترفيرون γ. يتم استخدام فحوصات الإفراج انترفيرون γ لتشخيص السل البقري والبشري وكشف في المقام الأول المستجيب والذاكرة المستجيب استجابات الخلايا T. استجابات الخلايا التائية الذاكرة المركزية من قبل خلايا CD4 + T للتلقيح، من ناحية أخرى، يمكن استخدامها للتنبؤ نجاعة اللقاح، كما هو موضح مع عدوى فيروس نقص المناعة القردي من الرئيسيات غير البشرية والسل في الفئران، والملاريا في البشر. وقد أثبتت العديد من الدراسات على الفئران والبشر فضلا عن بيانات غير منشورة على الماشية، أن الإنترفيرون γ المقايسات ELISPOT قياس الذاكرة المركزية استجابات الخلايا T. مع هذا الاختبار، وخلايا الدم وحيدات النوى المحيطية يتم تربيتها في خفض تركيز المستضد لمدة 10 إلى 14 يوما (ثقافة طويلة الأجل)، والسماح ردود المستجيب إلى ذروته ويضعف. تسهيل خلايا الذاكرة T المركزية للتمييز، وتوسيع إطار الثقافة.

ما يقرب من شهر واحد العدوى بعد الهباء الجوي مع M. البقرية (10 4 وحدات تشكيل مستعمرة)، PBMCs من المصابين (ن = 8) والحيوانات التحكم (ن = 8) كان المثقف في وجود مستضدات وIL-2 لمدة 13 يوما. وضع استجابات الطب الصينى التقليدى بعد الإصابة تم تحديد استخدام IFN-γ ELISPOT مقايسة. ممثل الطب الصينى التقليدى (في وجود أو عدم وجود ناقلات الجنود المدرعة) وخارج الحي IFN-γ الردود ELISPOT من الحيوانات المصابة (ثلاث الحيوانات) وحيوان غير مصاب (حيوان واحد) في الشكل 1. A ناجحة على المدى الطويل IFN-γ ELISPOT نتائج الفحص في الخلايا المنتجة IFN-γ (سبوت تشكيل خلايا، SFC) في ظل ظروف حفز وبالقرب من عدم وجود استجابة من الحيوانات غير المصابة وتحت ظروف غير حفز. أيضا، يجب أن يحدث رد فعل قوي خلية T ردا على PWM. استجابات محددة لM. تم تقييم البقرية التي كتبها PPD-B أو ريسات-6: CFP10 التحفيز الأنتيجين. كما هو مبين في الشكل<html> 1، قوي الطب الصينى التقليدى وخارج الحي الردود على PPD-B ورشات-6: تم الكشف عن CFP10 من كل ثلاثة M. البقرية -infected الحيوانات. تم الكشف عن الحد الأدنى للم الطب الصينى التقليدى وخارج الجسم الحي الاستجابات من الحيوان السيطرة. أيضا، كان مطلوبا وجود ناقلات الجنود المدرعة للاستجابات الطب الصينى التقليدى المثلى عن طريق الحيوانات المصابة، كما يتضح من تقلص إلى حد كبير ردود الخلايا على المدى الطويل مثقف في حالة عدم وجود ناقلات الجنود المدرعة ذاتي. استجابة IFN-γ التي كتبها PBMCs من M. البقرية المصابة ويتم عرض الحيوانات غير المصابة في الشكل 2. تم حساب عدد SFCs من كل حيوان حيث بلغ متوسط ​​عدد SFCs في عينات المكررة ردا على PPD-B ناقص استجابة منها إلى وسائل الإعلام وحدها. وقدرت الردود لمدة 10 6 خلايا. ردود اختلف (P &lt;0.05) على أساس الإصابة الوضع، وجود أو عدم وجود ناقلات الجنود المدرعة ومدة الثقافة (أي، على المدى الطويل ثقافة مقابل فيفو السابقين الثقافة). <table border="0" cellpaddin</html style=";text-align:right;direction:rtl">ز = &quot;0&quot; هوامش الخلية = &quot;0&quot;&gt; <colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> الحصول على صورة لوحات </td></tr><tr><td> 1. </td><td> تشغيل الجهاز </td></tr><tr><td> 2. </td><td> فتح &quot;المناعية لقطة&quot; النسخة 6.3 البرمجيات. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> الخطوة 1: حدد نوع لوحة. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> الخطوة 2: لوحة الحمل. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> الخطوة 3: تحديد خيارات المسح الضوئي. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> الخطوة 4: بدء المسح الضوئي. </td></tr><tr><td> 7. </td><td> الحصول على صورة نظرة عامة على لوحة. </td></tr><tr><td> 8. </td><td> إخراج اللوحة. </td></tr><tr><td> 9. </td><td> الإقلاع عن التدخين &quot;المناعية لقطة&quot; البرمجيات. </td></tr><tr><td colspan="2"> عد الوحدات بقعة تشكيل </td></tr><tr><td> 1. </td><td> فتح &quot;المناعي بقعة القبض على&quot; الإصدار 5.0 البرمجيات. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> حدد objec<html> نوع تي: عادي. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> اختر وحدة العد: العد الذكية. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> الخطوة 1: لوحة الحمل. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> الخطوة 2: تحديد معايير الفرز: دقة اختبار الاعتراف بقعة على الآبار مع وجود بقع مختلفة. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> بدء العد السيارات. </td></tr><tr><td colspan="2"> ضبط الجودة </td></tr><tr><td> 1. </td><td> فتح &quot;Immunospot القبض على&quot; الإصدار 5.0 البرمجيات. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> اختر وحدة العد: مراقبة الجودة. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> الخطوة 1: لوحة الحمل. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> خطوة 2: تحليل الآبار المميزة على حدة. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> الانتهاء من مراقبة الجودة. </td></tr></tbody></table> الجدول 1 - AutoImmun DIAGNOSTIKA ELISPOT اكتساب القارئ صورة وخلايا العد الداخلي. ove_content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig1.jpg" /> الشكل 1. صورة من الآبار من IFN- مثقف على المدى الطويل γ ELISPOT مقايسة. تم إجراء مثقف-γ IFN ELISPOT مقايسة approximatelyone بعد شهر من التحدي مع ضراوة M. البقرية (ثلاثة حيوانات). أدرجت الحيوانات غير المصابة والضوابط (حيوان واحد) تم إنشاؤها خطوط الخلايا على المدى الطويل من خلال تحفيز PBMC مع كوكتيل من Ag85A المؤتلف (1 ميكروغرام / مل)، TB10.4 (1 ميكروغرام / مل)، رشاد-6: CFP10 (1 ميكروغرام / مل)، وPPD-B (5 ميكروغرام / مل) لمدة 13 يوما تليها نقل لوحات ELISPOT في وجود أو عدم وجود ذاتي APC. وتألفت الخلايا على المدى القصير من PBMC معزولة في يوم 13 ومطلي مباشرة في لوحات ELISPOT. وقد حفز خلايا طويلة الأجل وقصيرة الأجل مع PPD-B (10 ميكروغرام / مل)، رشاد-6: CFP10 (1 ميكروغرام / مل) ومتوسطة وحدها أو الفتلاق mitogen (5 &amp;# 956؛ ز / مل) لمدة 24 ساعة. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig2.jpg" /> الشكل 2. ممثل النتائج من IFN- مثقف على المدى الطويل γ استجابة ELISPOT إلى M. البقرية تنقية البروتين المشتق تم تنفيذ (PPD-B). مثقف IFN-γELISPOT فحص approximatelyone بعد شهر من التحدي مع ضراوة M. البقرية (ثمانية حيوانات). أدرجت الحيوانات غير المصابة والضوابط (تم إنشاؤها خلايا ثمانية حيوانات طويل الأجل من خلال تحفيز PBMC مع كوكتيل من Ag85A المؤتلف (1 ميكروغرام / مل)، TB10.4 (1 ميكروغرام / مل)، رشاد-6: CFP10 (1 ميكروغرام / مل)، وPPD-B (5 ميكروغرام / مل) لمدة 13 يوما تليها نقل لوحات ELISPOT في وجود أو عدم وجود ناقلات الجنود المدرعة ذاتي. وتألفت الخلايا على المدى القصير من PBMC معزولة في يوم 13 ومطلي مباشرة في لوحة ELISPOT . الطويلة الأجل وSHOوقد حفز خلايا غ الأمد مع PPD-B (10 ميكروغرام / مل) أو المتوسطة وحدها لمدة 24 ساعة. يتم تقديم استجابات محددة من كل حيوان (SFC / 10 6 خلايا)، وردا على PPD-B (متوسط ​​العينات المكررة) ناقص ردا على وسائل الإعلام وحدها.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Long-term cultured Interferon-ÃŽÂ³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle at JoVE.com

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

ويستخدم على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط immunospot فحص كإجراء الردود الذاكرة المركزية ويرتبط مع الاستجابات لقاح لمكافحة المتفطرات واقية. مع هذا الاختبار، يتم تحفيز الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي مع المستضدات المتفطرات وانترلوكين 2 لمدة 14 يوما، والتمايز تمكين وتوسيع الخلايا التائية الذاكرة المركزية.

تطبيق على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط Immunospot الفحص لتقييم المستجيب والذاكرة T الردود خلية في الماشية

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

انزيم مرتبط Immunospot الفحص (ELISPOT) : القياس الكمي للردود TH - 1 المناعة الخلوية ضد مولدات المضادات الجرثومية

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

استخدام مضاد للفيروسات، γ الإنزيم المرتبط الفحص Immunospot لوصف الرواية تي خلية الحواتم من فيروس الورم الحليمي البشري

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

في المختبر الفحص لتقييم أثر مناعة مقررات تمهيدية بشأن فيروس نقص المناعة CD4 T محددة المستجيب خلية وظيفة

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي<em&gt; في الجسم الحي</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

و إيل-8 عابر نموذج الماوس المعدلة وراثيا ل<em&gt; في فيفو</em&gt; رصد طويل الأمد للردود الالتهابية

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

A المناعة الذاتية الجفاف العين الفئران نموذج مع زيادة في المفعول الذاكرة خلايا T في الأنسجة مقلة العين

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...