Name: application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle
Uploaded: 2015-07-11T13:00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Long-term cultured Interferon-ÃŽÂ³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle at JoVE.com

מחקר נתמך על ידי משרד החקלאות, ARS קריס: 3625-32000-104 וחקלאות ומזון מחקר יוזמה התחרותי גרנט לא. 2011-67015-30736 מהמכון הלאומי USDA של מזון וחקלאות. אנו מודים ג&#39;סיקה פולוק, אמה Frimml-מורגן, שלי צימרמן, קריסטין בס, ברוס פש, מולי Stafne, אלן ג&#39;נסן, וטרייסי פורטר לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלהם, כמו גם רבקה מדיסון, דאג יואינג, קייטי פייה, ג&#39;יי סטפן, דוד Lubbers , רובין Zeisness, ודוד Panthen לטיפול וטיפול המעולה של בעלי חיים.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ייצור IFN-γ במבחני ELISPOT תרבותיים לטווח הארוך הוא בדרך כלל עקב Trinidad &amp; בבני אדם, אבל איך תגובה זו מתפתחת בתרבות הוא הבין היטב. אם Trinidad &amp; נמצא במחזור ולהרחיב במבחנה, או אם תגובות Trinidad &amp; נובעות מבידול של מפעיל ותאי Tem לTrinidad &amp; בתרבות אינו ידוע. עם זאת, מחקרים עם דגימות מבני האדם מצאו כי יש תאי CD4 + T מvivo לשעבר ומבחני ELISPOT IFN-γ התרבותי ארוך טווח ספציפיות epitope שאינן קשורות, רומזים כי תגובות Trinidad &amp; לא לפתח מתאי מפעיל 28. ברור, את משך התגובה עשוי להשתנות, אבל אם אישור הפתוגן מושגת, סופו של דבר שניהם vivo לשעבר ותגובות Trinidad &amp; לרדת. כמו כן, תגובות של תרבויות ארוכת טווח שנמדדו בתחילת וזמן רב לאחר תחול אנטיגני (כאשר תגובת מפעיל היא נמוכה יותר) מוצג לתאם, המציין כי במחזור אוכלוסיות Trinidad &amp; המוקדם וארוך לאחר אנטיתחול genic נשאר קשור in vivo. מצד שני, עוצמת תגובת vivo לשעבר אינה מופיעה להיות קשורה לעוצמת תגובת הזיכרון 29. תוצאות אלו מצביעות על כך שתגובות γ-IFN תרבותיים לטווח ארוך כתוצאה מהתרחבות ELISPOT במבחנה של TCM ודעיכה קשורה של תגובות מפעיל במדגם, ולא ההתמיינות של תאי מפעיל לפנוטיפ TCM. עם הבקר, את התרומה היחסית של תת מפעיל וזיכרון לתגובות זוהתה על ידי מבחני ELISPOT IFN-γ לטווח הארוך אינה ידועה. מחקרים שנעשה לאחרונה מצביעים על מתאם בין החיסון עורר תגובות לטווח ארוך בתרבית γ-IFN ELISPOT והגנה מפני זיהום הניסיון הבא עם מ &#39; בוביס 23-24. זה כבר דווח כי תגובות חלשות לטווח ארוך IFN-γ ELISPOT לחיסון קשורים להיעדר ההגנה 30. שניהם חיים ולהרוגחיסוני אד לגרום תגובות ELISPOT vivo IFN-γ דומות לשעבר, אבל חיסון BCG עם החיה מעורר תגובות חזקות לטווח ארוך בתרבית γ-IFN ELISPOT מאשר לעשות הכנות חיסון נהרגו. מעניין לציין, חיסונים חיים הם הגנה תוך ניסוחים נהרגו אינם מספקים הגנה מפני אתגר עם mycobacteria הארסית שחפת 31-32, 33. הערכה של תגובות Trinidad &amp; היא גם אפשרית על ידי מיון תאים אלה מPBMC. העשרה ישירה של TCM מPBMC, לעומת זאת, דורשת מכשירים יקרים, מאומנים אישי וקשה כמו תאים אלה אינם רבים בזרם הדם. תרבות לטווח הארוך של PBMC מספקת העשרה של TCM על TEM ותאי מפעיל ללא מכשירים יקרים; עם זאת, מכיוון שאוכלוסיות תאי T אלה הרחיבו במבחנה הם עשויים להיות פחות נציג של תגובות זיכרון in vivo. אפשר לגשת לתגובות זיכרון IFN-γ (באמצעות התרבות לטווח הארוך או סוג Trinidad &amp;ing אסטרטגיות) על ידי מבחני אחרים מאשר ELISPOT כגון: ELISAs ציטוקינים 34, מערכי חרוז ציטוקינים (CBA), מכתים תאיים (ICS), או מערכי חלבון ציטוקינים (רו&quot;ח). שיטות אלה; עם זאת, בדרך כלל פחות רגישים מאשר ELISPOT מבחני 35. יתרון של ELISPOT הוא היכולת שלה לזהות את הלכידה המיידית של ציטוקינים זמן קצר לאחר שחרורו מניעת דילול בsupernatant והשפלה על ידי מחשוף האנזימטית או ספיגת ציטוקינים על ידי תאים אחרים. מבחני ELISPOT לזהות תאים בודדים ייצור ציטוקינים לספק תוצאות מדויקות אפילו באות נמוכה לתרחישי רעש (כלומר, תגובות ספציפיות נמוכות) 35. כמו כן, עם ICS, זיהוי של ציטוקינים לפני השחרור עלול לגרום לזיהוי מוטעה של תאים מייצרים ציטוקינים (למשל., בשל אפנון לאחר translational לפני או במהלך תהליך ההפרשה) 34. מעכבי התחבורה מועסקים במבחני ICS כדי למזער הפרשת ציטוקיניםבמהלך גירוי אנטיגן (המכונה חלבוני תחנת Golgi) להגביל את משך הזמן של גירוי תא בשל רעילות התא של חלבונים אלה סופו של דבר משפיעים על ייצור ציטוקינים 35. עם זאת אמרה - CBA, רו&quot;ח וICS טכניקות שימושיות למדידת ציטוקינים מרובים בו זמנית ו / או לקביעת ביטוי סמן תא שטח (כלומר, עם ICS.). לכן, שיטות אלה יכולים לשמש בשילוב עם assay ELISPOT γ-IFN 36. בעוד שמחקרי יעילות חיסון שחפת הבקר קודמים נמדדו תגובות Trinidad &amp; באמצעות assay ELISPOT, זיהוי של תגובות Trinidad &amp; על ידי טכניקות אחרות צפוי להניב תוצאות דומות. חשוב לציין, assay ELISPOT הוא פחות יקר ופשוטה לביצוע מאשר CBA, טכניקות רו&quot;ח וניתוח ICS 34. ספירה ידנית של SFC היא אלטרנטיבה לספירה אוטומטית, וניתן לאחסן צלחות ELISPOT ב RT לתקופה ארוכה של זמן עם אובדן איכות מינימאלי, לפני או אחרי הנקודה גounting 37. תגובת γ-IFN התרבותית ארוך טווח ELISPOT יושמה להעריך תגובות זיכרון על ידי אדם, ובקר בעת הערכת תגובות חיסון שחפת 14-16,31-32,33. תגובות TCM גם הם הניחו לשחק תפקידים משמעותיים בתגובות מארח לכמה סוכנים אחרים זיהומיות של בקר, כגון:. mycoides Mycoplasma mycoides subsp 42, Anaplasma marginale 38 ווירוס syncytial נשימה שור 39. פוטנציאלי, assay ELISPOT לטווח הארוך עשוי להיות מותאם לבעלי חי מינים, ציטוקינים וזיהומים אחרים. יישומים רחבים יותר אלה יהיו שימושיים במיוחד עבור יישומי אימונולוגיה וטרינרים בשל זמינות מוגבלת של חומרים כימיים מסוימים. תגובות TCM הן חיוניות להגנה מפני זיהומים כמה, אבל מדידה אותם מוקדם לאחר הדבקה / חיסון (לחיזוי תוצאת מחלה או יעילות חיסון) may להיות מסורבל. ניתוח של התגובה החיסונית תחת vivo לשעבר ותנאי גירוי אנטיגני קצרים יותר לעתים קרובות מייצג תגובות מפעיל, בשל החפיפה של תגובות וזכרון מפעיל, במיוחד בתחילת היווצרות זיכרון חיסונית. בהקשר של מחלות כרוניות שבעומס אנטיגן הוא מתמשך, תגובות vivo לשעבר תהיה להעריך תגובות תא מפעיל או שילוב של תגובות זיכרון ותא מפעיל. Assay γ-IFN התרבותי ארוך טווח ELISPOT, שתואר כאן, סביר להניח מאפשר המדידה של תגובות Trinidad &amp; ולא תא T מפעיל או תגובות של תאי CD4 + בשילוב. לסיכום, assay γ-IFN התרבותי ארוך טווח ELISPOT מספק גישה רבת ערך להערכת תגובות זיכרון תא T וכבר מועסק בהצלחה על מנת להעריך את תגובות של כמה מיני זיכרון למגוון רחב של סוכני זיהומים 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

תאי מפעיל וT הזיכרון נוצרים באמצעות תיכנות ההתפתחותי של תאי CD4 + T הנאיביים לאחר הכרת אנטיגן. התמיינות של תאי CD4 + T הנאיביים לתאי ציטוקינים הפקה דורשת הכרת הפתוגן על ידי תאי מערכת חיסון מולדים, הצגת אנטיגן לתאי T, שיתוף גירוי ושינויי תעתיק וכתוצאה מכך ייצור ציטוקינים מקוטב. לדוגמא: תאי הצגת אנטיגן לייצר אינטרלוקין (IL) -12 בתגובה לפתוגנים תאיים, אשר, יחד עם הכרת אנטיגן, מקדם התמיינות של תאי T לעוזר T 1 תאים (Th1) 1,2 על ידי איתות באמצעות מתמר אות ומפעיל של שעתוק 4 (STAT4) ו- T-תיבה לידי ביטוי בתאי T (T-הימור), שמוביל להפעלת תא, IL-2 ייצור, הרחבה משובט ואינטרפרון (IFN) ייצור -γ 3,4. אם הזיהום נשלט, עד 95% מתאי T שנוצרו בשלב ההרחבה בוטלו (כלומר, התכווצותתאי שלב) וT הזיכרון יישארו, לפעמים לכל חיים 5. Sallusto et al. 6, חשפו שני תת תפקודי שונים של תאי T זיכרון בבני אדם המבוססים על הביטוי של קולטנים ביות בלוטה לימפה. תאי T הזיכרון מרכזי (TCM) להביע את קולט chemokine CC (CCR) -7 וCD45RO וממוקמים בעיקר באזורי T-cell של איברי הלימפה משניים. TCM מוגבל תפקוד מפעיל, סף הפעלה נמוך ולשמור על ייצור IL-2 גבוה ויכולת שגשוג. תאי T זיכרון מפעיל (TEM) להביע CD45RO, חסרים קולטני CCR7 ותצוגה לביות לרקמות היקפיים או מודלקות. תאי מפעיל אינם מבטאים גם CCR7 או CD45RO אבל מייד לייצר ציטוקינים מפעיל, כגון IFN-γ, בעת הכרת אנטיגן. מבחני שחרור IFN-γ (IGRA) משמשים לאבחון של שור ושחפת אדם 7. Mycobacterium וביס הוא הסוכן העיקרי של שחפת הבקר (BTB) תוך CA האנושיSES של שחפת נגרמים בעיקר על ידי שחפת Mycobacterium. עם בדיקות אלה, כל דם או תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) מומרצים עם אנטיגנים mycobacterial ל16-24 שעות וייצור IFN-γ בתוך supernatant נמדד על ידי ELISA או באמצעות זיהוי של תאים מייצרים IFN-γ תוך שימוש בטכניקות ELISPOT. כתוצאה מתקופת הגירוי הקצרה (כלומר., 16 עד 24 שעות) וייצור ציטוקינים מהיר, מבחני vivo לשעבר לזהות בעיקר תגובות מפעיל וTEM. זה אושר על ידי ניתוח התזרים cytometric של אוכלוסיות תאים בתרבויות אלה 8-10. Vivo לשעבר תגובות IFN-γ כלולים באופן שיגרתי בהערכת פנל תגובה החיסונית של חיסוני שחפת, לרבות אלה המשמשים להערכת תגובות על ידי בקר. רוב חיסוני שחפת הבקר יעילים לעורר תגובת IFN-γ ספציפי, אך לא את כל החיסונים שגורמים לתגובות IFN-γ הם protectivדואר. כמו כן, הרמות של IFN-γ שהושרו על ידי חיסון, כפי שנמדד לפני הזיהום, לא בהכרח תואמות את ההגנה. לדוגמא, ייתכן שיש לי זני BCG שונים יכולות שונות כדי לגרום לvivo לשעבר תגובת IFN-γ, למרות רמות הגנה דומות 11. לפיכך, vivo לשעבר IGRAs הם בעלי ערך לאבחון שחפת ולגישה חיסוני חיסון; עם זאת, השימוש בם כמנבאים של יעילות חיסון הוא מוגבל. תגובות TCM לחיסון, לעומת זאת, ניתן להשתמש כדי לחזות את יעילות חיסון, כפי שהודגמו עם זיהום בנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) בפרימטים לא אנושיים 12,13, שחפת בעכברי 14 ומלריה בבני האדם 15,16. לאחר תגובה חיסונית יעילה וכתוצאה מכך אישור הפתוגן, TCM נשמרים ולספק הגנה לזיהום שני סופו של דבר על ידי אותו הסוכן. יוצא דופן בולטת לתרחיש זה היא מ &#39; infe שחפתסיפורת של בני אדם שבו חולים שקבלו טיפול אנטי-mycobacterial מרפא רגישות לזיהום מחדש 17,18. בנוסף, אירועים המסדירים זיכרון חיסוני במהלך זיהומים כרוניים, שבו גירוי אנטיגני נמשך, אינם מובנות היטב 19. במהלך זיהומים כרוניים, כגון בוירוס כשל חיסוני אנושי (HIV) ושחפת, תגובת Trinidad &amp; משמעותית קשורה לתוצאה חיובית (לדוגמא, חביון עם שחפת ותת-קליניים עם HIV) 20,21. מספר מחקרים בעכברים ובבני אדם הראו כי מבחני ELISPOT לטווח ארוך בתרבית IFN-γ למדוד תגובות Trinidad &amp; 16,20-22. עם assay זה, PBMCs בתרבית בהפחתת ריכוז של אנטיגן במשך 10 עד 14 ימים, ומאפשר תגובות מפעיל לשיא ולדעוך; הקלת Trinidad &amp; לבדל ולהרחיב בתוך התרבות. מבחני ELISPOT לטווח ארוך בתרבית IFN-γ יש גם שימשו בוטרינריםמחקר, עדיין הפנוטיפ של תאים להגיב כבר קשה להעריך בשל חוסר של חומרים כימיים קריטיים, במיוחד נוגדן לCCR7. חיסוני שחפת הבקר יעילים [למשל. באמצעות מנה אחת של מ &#39; בוביס Bacille Calmette גרן (BCG), BCG אחרי חיסון-וקטורים נגיפיים Antigen 85A מקטע, או M מוחלש. וביס ΔRD1] לעורר תגובה לטווח ארוך בתרבית γ-IFN ELISPOT הבאה חיסון המתואמים עם הגנה (כלומר, נטל mycobacterial נמוך וירידה ב הפתולוגיה הקשורים TB) נגד האתגר הבא עם מ &#39;הארסי בוביס 23,24. יתר על כן, מספרם של תאי IFN-γ-מפריש אנטיגן הספציפי בתוך תרבויות PBMC לטווח ארוך הם גבוהים יותר בגיל 12 חודשים, אך להקטין ב 24 חודשים לאחר חיסון BCG של עגלים בילוד, מקשר עם התואר של פוסט זיהוי הגנה מ &#39; אתגר בוביס 25. בתרחיש זה, IFN-γ ELISPOT התרבותית היאכלי חשוב n לניבוי יעילות חיסון, מתן אמצעים כדי לתעדף מועמדי חיסון לניסויי יעילות עלות גבוהה. בנוסף, ניתן להתאים טכניקות ELISPOT תרבותית עבור מארחים, פתוגנים וציטוקינים שונים על ידי שינוי אנטיגנים או נוגדנים למגוון רחב של מטרות בתחומי מחקר שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sodium citrate (dihydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citric acid (monohydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dextrose</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT PVDF plate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC &#8211; AP KIT Standard</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>AK-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag85A</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0004.3</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB 10.4</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0061.6</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPDb</td>
			<td>Prionics AG</td>
			<td>7600055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rESAT-6:CFP10</td>
			<td>Kind gift Dr. Minion, Iastate</td>
			<td></td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783B</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Biotinylated Clone CC330</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2112</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1653GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2434GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-human CCR7 Clone 3D12</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947;-Pe Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7</td>
			<td>SouthernBiotechnology</td>
			<td>1080-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm&#8482;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrefeldinA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed Mitogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat human Interleukin 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle

תאי מפעיל וT הזיכרון נוצרים באמצעות תיכנות ההתפתחותי של תאים נאיביים הבאות הכרת אנטיגן. אם הזיהום נשלט עד 95% מתאי T שנוצרו בשלב ההרחבה בוטלו (כלומר., שלב התכווצות) ותאי T הזיכרון יישארו, לפעמים לכל חיים. בבני אדם, שני תת תפקודי שונים של תאי T זיכרון תוארו מבוססת על הביטוי של קולטנים ביות בלוטה לימפה. תאי T זיכרון מרכזי לבטא קולט CC chemokine 7 וCD45RO וממוקמים בעיקר באזורי T-cell של איברי הלימפה משניים. תאי T זיכרון מפעיל להביע CD45RO, חסרים קולטני CCR7 ותצוגה הקשורים ביות הלימפוציטים לרקמות היקפית או מודלקות. תאי מפעיל T אינם מבטאים גם CCR7 או CD45RO אלא על מפגש עם ציטוקינים מפעיל תוצרת אנטיגן, כגון אינטרפרון-γ. מבחני שחרור אינטרפרון-γ משמשים לאבחון של שור ושחפת אדם ולזהות בעיקר מפעיל ותגובות תא T זיכרון מפעיל. תגובות תא T הזיכרון מרכזית על ידי תאי CD4 + T כדי חיסון, לעומת זאת, ניתן להשתמש כדי לחזות את יעילות חיסון, כפי שהודגמו עם זיהום קופי וירוס הכשל החיסוני של קופים שאינם בני אדם, שחפת בעכברים, ומלריה בבני אדם. מספר מחקרים בעכברים ובבני אדם, כמו גם נתונים שלא פורסמו בבקר, הוכיחו כי מבחני ELISPOT אינטרפרון-γ למדוד תגובות תא T זיכרון מרכזי. עם assay זה, תאי הדם היקפיים mononuclear בתרבית בהפחתת ריכוז של אנטיגן במשך 10 עד 14 ימים (לטווח ארוך תרבות), המאפשר תגובות מפעיל לשיא ולדעוך; הקלת תאי T הזיכרון מרכזיים לבדל ולהרחיב בתוך התרבות.

כ זיהום פוסט-תרסיס של חודש אחד עם מ &#39; בוביס (10 4 יחידות מושבה יוצרים), PBMCs מנגוע (n = 8) ובעלי חיים ביקורת (n = 8) היו בתרבית בנוכחות של אנטיגנים וIL-2 במשך 13 ימים. פיתוח של תגובות Trinidad &amp; לאחר ההדבקה נקבע באמצעות assay ELISPOT IFN-γ. נציג TCM (בנוכחות או עדר של נגמ&quot;שים) לשעבר vivo IFN-γ תגובות ELISPOT מבעלי חיים נגועים (שלושה בעלי חיים) ושאינם נגועים בבעלי חיים (בעלי חיים אחד) מוצגים באיור 1. IFN-γ מוצלח לטווח ארוך תוצאות ELISPOT assay בתאי ייצור IFN-γ (ספוט-יצירת תאים, SFC) בתנאי מגורה וליד העדר תגובה מבעלי חיים הנגועים שאינם ובתנאים שאינם מגורה. כמו כן, תגובה של תאי T חזק צריכה להתרחש בתגובה לPWM. מענה ספציפי למ &#39; בוביס הוערך על ידי PPD-B או rESAT-6: גירוי אנטיגני CFP10. כפי שניתן לראות באיור<html> 1, TCM חזק וvivo לשעבר תגובות לPPD-B וrESAT-6: CFP10 אותרו מכל שלוש מ &#39; בוביס -infected בעלי חיים. מינימאלי ללא TCM ותגובות vivo לשעבר התגלו מחית השליטה. כמו כן, הנוכחות של נגמ&quot;שים נדרשה לתגובות Trinidad &amp; אופטימליות על ידי בעלי חיים נגועים, כפי שהודגמה על ידי תגובות מופחתות במידה ניכרת על ידי תאים בתרבית לטווח ארוך, בהעדר נגמ&quot;שים אוטולוגית. תגובת IFN-γ על ידי PBMCs ממ &#39; בוביס נגוע ובעלי חיים נגועים שאינם מוצגים באיור 2. מספר SFCs מכל חיה חושב כממוצע של SFCs בדגימות כפולות בתגובה לPPD-B מינוס התגובה המתאימה לתקשורת בלבד. תגובות נאמדו עבור 10 6 תאים. תגובות שונות (P &lt;0.05) המבוסס על זיהום מעמד, נוכחות או עדר של נגמ&quot;שים ומשך התרבות (, לעומת vivo לשעבר תרבות תרבות לטווח ארוך כלומר.). <table border="0" cellpaddin</html style=";text-align:right;direction:rtl">= Cellspacing &quot;0&quot; ז = &quot;0&quot;&gt; <colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> רכישת תמונה של צלחות </td></tr><tr><td> 1. </td><td> הפעל מכונה </td></tr><tr><td> 2. </td><td> פתוח &quot;לכידת חיסונית&quot; תוכנת גרסת 6.3. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> שלב 1: סוג צלחת נבחרת. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> שלב 2: צלחת עומס. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> שלב 3: בחר אפשרויות סריקה. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> שלב 4: להתחיל בסריקה. </td></tr><tr><td> 7. </td><td> להשיג תמונת סקירה של צלחת. </td></tr><tr><td> 8. </td><td> הוצא צלחת. </td></tr><tr><td> 9. </td><td> צא תוכנה &quot;לכידת החיסוני&quot;. </td></tr><tr><td colspan="2"> ספירת יחידות הנקודה להרכיב </td></tr><tr><td> 1. </td><td> פתח &quot;לכידת ספוט החיסוני&quot; תוכנת גרסת 5.0. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> objec בחר<html> סוג T: רגיל. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> מודול בחר ספירה: ספירה חכמה. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> שלב 1: צלחת עומס. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> שלב 2: להגדיר פרמטרים ספירה: דיוק בדיקה של הכרת נקודה על בארות עם כתמים שונים. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> התחל לספור אוטומטי. </td></tr><tr><td colspan="2"> בקרת איכות </td></tr><tr><td> 1. </td><td> פתוח &quot;לכידת Immunospot&quot; תוכנת גרסת 5.0. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> מודול בחר ספירה: בקרת איכות. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> שלב 1: צלחת עומס. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> שלב 2: לנתח בארות מסומנת בנפרד. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> לסיים בקרת איכות. </td></tr></tbody></table> טבלת 1 - רכישת תמונת קורא AutoImmun Diagnostika ELISPOT ותא ספירת הליך. ove_content &quot;FO: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig1.jpg" /> תמונת 1. איור של בארות מIFN- תרבותית ארוך טווח γ assay ELISPOT. Assay ELISPOT γ-IFN מתורבת בוצעה חודש לאחר approximatelyone אתגר עם מ &#39;הארסי בוביס (שלושה בעלי חיים). בעלי חיים שאינם נגועים נכללו כביקורת (חיה אחת) שורות תאים לטווח ארוך נוצרו על ידי גירוי PBMC עם קוקטייל של Ag85A רקומביננטי (1 מיקרוגרם / מיליליטר), TB10.4 (1 מיקרוגרם / מיליליטר), rESAT-6.: CFP10 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) וPPD-B (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 13 ימים ואחריו העברה לצלחות ELISPOT בנוכחות או עדר של APC אוטולוגית. תאים לזמן קצר כללו PBMC מבודד ביום 13 ומצופה ישירות לתוך צלחות ELISPOT. תאים לטווח ארוך וטווח קצר היו מגורה עם PPD-B, rESAT-6 (10 מיקרוגרם / מיליליטר): CFP10 (1 מיקרוגרם / מיליליטר), mitogen בינוני לבד או פיטולקה (5 &amp;# 956; ג &#39;/ מיליליטר) במשך 24 שעות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig2.jpg" /> איור 2. תוצאות נציגת IFN- תרבותית ארוך טווח γ תגובת ELISPOT למ &#39; נגזר חלבון מטוהר בוביס (PPD-B). assay מתורבת IFN-γELISPOT בוצע חודש לאחר approximatelyone אתגר עם מ &#39;הארסי בוביס (שמונה בעלי חיים). בעלי חיים שאינם נגועים נכללו כביקורת (תאי שמונה בעלי חיים לטווח ארוך נוצרו על ידי גירוי PBMC עם קוקטייל של Ag85A רקומביננטי (1 מיקרוגרם / מיליליטר), TB10.4 (1 מיקרוגרם / מיליליטר), rESAT-6: CFP10 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) וPPD-B (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 13 ימים ואחריו העברה לצלחות ELISPOT בנוכחות או עדר של נגמ&quot;שים אוטולוגית. תאים לזמן קצר כללו PBMC מבודד ביום 13 ומצופה ישירות לתוך צלחת ELISPOT . לטווח ארוך וshoתאי RT-טווח היו מגורה עם PPD-B (10 מיקרוגרם / מיליליטר) או בינוני לבד במשך 24 שעות. תגובות ספציפיות מכל חיה (SFC / 10 6 תאים) מוצגות כתגובה לPPD-B (ממוצע של דגימות כפולות) מינוס התגובה לתקשורת בלבד.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Long-term cultured Interferon-ÃŽÂ³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle at JoVE.com

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי צמוד אנזים משמש כמדד לתגובות זיכרון מרכזיים וקורלציה עם תגובות חיסון נגד mycobacterial מגן. עם assay זה, תאי דם היקפי mononuclear הם מגורה עם אנטיגנים mycobacterial וinterleukin-2 במשך 14 ימים, מה שמאפשר בידול והתרחבות של תאי T הזיכרון מרכזיים.

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

כרוני אוטואימונית יבש עין עכברוש דגם עם הגדלת זיכרון תאי זיכרון T ב Eyeball רקמות

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...