Name: application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle
Uploaded: 2015-07-11T13:00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Long-term cultured Interferon-ÃŽÂ³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle at JoVE.com

Исследования выполнены при поддержке Министерства сельского хозяйства США, ARS Cris: 3625-32000-104 и сельского хозяйства и продовольственной инициативы исследований Конкурсная Грант нет. 2011-67015-30736 от USDA Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства. Мы благодарим Джессика Поллок, Эмма Frimml-Морган, Шелли Циммерман, Кристин Басс, Брюс Пеш, Молли Stafne, Аллен Дженсена, и Трейси Портер за отличную техническую помощь, а также Ребекка Мэдисон, Дуг Юинг, Кэти PILLE, Джей Штеффен, Дэвид Любберса Робин Zeisness, и Дэвид Panthen за отличную уходу и обращению с животными.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Производство IFN-γ в долгосрочных культурных ELISPOT анализов, как правило, из-за трлн.куб.м в людях, но, как эта реакция развивается в культуре плохо изучены. Будь Tcm присутствуют в обращении и расширяться в пробирке, или ответы Tcm результате дифференциации эффектора и ТЕА клеток в течение трлн.куб.м культуры не известно. Тем не менее, исследования с образцами из людей обнаружили, что CD4 + T-клетки из экс естественных условиях и долгосрочных культивируют ИФН-γ ELISPOT анализы, не связанных эпитопные особенности, подразумевая, что ответы Tcm не развиваются из клеток-эффекторов 28. Очевидно, что продолжительность реакции может изменяться, но если патоген зазора достигается, в конечном итоге, как экс виво и ответы Tcm снижаться. Кроме того, реакции длительных культур измеряется рано и долго после антигенной грунтовки (когда ответ эффектор ниже) показано, коррелируют, указывая, что циркулирующий популяции TCM рано и долго после антигенная грунтовки, остается связанным в естественных условиях. С другой стороны, величина экс естественных ответ, кажется, не быть связана с величиной отклика памяти 29. Эти результаты показывают, что долгосрочные культивированный IFN-γ ELISPOT ответы в результате расширения в пробирке Tcm и ассоциированного ослаблением реакций эффекторных в образце, а не дифференциации клеток-эффекторов в фенотипе TCM. С крупного рогатого скота, относительный вклад эффекторов и памяти подмножеств в ответах обнаруживается долгосрочных ИФН-γ ELISPOT анализов не известны. Последние исследования показывают, корреляция между вакциной вызвало долгосрочные культурные IFN-γ ELISPOT ответы и защиту от последующей экспериментальной инфекции M. Бови 23-24. Было сообщено, что слабые долгосрочные IFN-γ ELISPOT ответы на вакцинации связаны с отсутствием защиты 30. Оба живут и убиваютред вакцины индуцируют аналогичные бывших естественных ИФН-γ ELISPOT ответы, но вакцинация БЦЖ с живой вызывает сильные долгосрочные культурные IFN-γ ELISPOT ответы, чем сделать убитых вакцинные препараты. Интересно, что живые вакцины защищают, а убитые препараты не обеспечивают защиту против заражения вирулентным туберкулезной микобактерии 31-32, 33. Оценка ответов TCM также возможно путем сортировки эти клетки из РВМС. Прямая обогащение Tcm из РВМС, однако, требует дорогих устройств, высококвалифицированных личной и трудно, поскольку эти клетки не многочисленны в кровотоке. Долгосрочный культура РВМС обеспечивает обогащение трлн.куб.м над ТЕА и эффекторных клеток без дорогостоящих приборов; Однако, поскольку эти Т-клеточные популяции расширены в пробирке они могут быть менее представитель в естественных условиях ответов памяти. Можно получить доступ к ответов ИФН-γ памяти (с помощью долгосрочного культуру или TCM-тоING стратегии) ​​от других, чем ELISPOT анализов, таких как: ИФА цитокинов 34, массивов цитокинов борта (СВА), внутриклеточного окрашивания (ICS), или цитокинов белковыми массивов (CPA). Эти методы; Однако, как правило, менее чувствительны, чем ELISPOT анализах 35. Преимущество ELISPOT является его способность обнаруживать немедленного захвата цитокина вскоре после его выхода предотвращения разбавления в надосадочной жидкости и деградации ферментативным расщеплением или поглощения цитокинов другими клетками. ELISPOT анализы обнаружить отдельные клетки, продуцирующие цитокины, обеспечивающие точные результаты даже в условиях низкой сигнала сценариев шума (т.е., низкие удельные ответов) 35. Кроме того, с ICS, обнаружение цитокинов до выпуска может привести к ложной идентификации клеток, продуцирующих цитокины (например., В связи с пост-трансляционной модуляции до или во время процесса секреторной) 34. Ингибиторы транспорта, используемые с ICS анализов, чтобы минимизировать секрецию цитокиновво антигенной стимуляции (известный как Гольджи стоп белков) ограничить продолжительность стимуляции клеток из-за токсичности клеток этих белков, в конечном счете, влияющих на продукцию цитокинов 35. С учетом сказанного - CBA, ВМС и МПС полезные методы измерения нескольких цитокинов одновременно и / или для определения экспрессии маркера клеточной поверхности (т.е. с ICS.). Таким образом, эти методы могут быть использованы в сочетании с IFN-γ ELISPOT анализа 36. В то время как предыдущие бычьего туберкулеза исследования эффективности вакцины измеряли ответов TCM с помощью ELISPOT анализа, обнаружение ответов TCM другими методами, скорее всего, дают сопоставимые результаты. Важно отметить, что ELISPOT анализ является менее дорогостоящим и более простым для выполнения, чем СВА, CPA и анализа ИКС методов 34. Руководство подсчет SFC является альтернативой автоматизированной подсчета и ELISPOT пластины можно хранить при комнатной температуре в течение длительного периода времени с минимальной потерей качества, до или после точечной Counting 37. Долгосрочная культивируют ИФН-γ ELISPOT ответ был применен для оценки ответов памяти от человека и крупного рогатого скота, при оценке ответов вакцины туберкулеза 14-16,31-32,33. Ответы Tcm также предполагается играть значительную роль в ответах принимающих несколько других инфекционных агентов крупного рогатого скота, таких как:. Микоплазмы тусоШез подвид тусоШез 42, Anaplasma marginale 38 и бычьего респираторно-синцитиальный вирус 39. Потенциально, долгосрочный анализ ELISPOT может быть адаптирована для других животных видов, цитокинов и инфекций. Эти более широкие приложения будут особенно полезны для ветеринарного применения иммунологии в связи с текущей ограниченной доступности специфических реагентов. Ответы Tcm имеют решающее значение для защиты от нескольких инфекций, но их измерения в ранние сроки после инфекции / иммунизации (для предсказания исхода болезни или эффективности вакцины) MAу громоздким. Анализ иммунного ответа при экс естественных условиях и коротких антигенных условиях стимуляция чаще представляют ответов эффекторных, в связи с перекрытием памяти и эффекторных реакций, особенно в начале становления иммунологической памяти. В контексте хронических заболеваний, при которых нагрузка антиген постоянное, Экс Vivo ответы будут оценивать клеточные ответы эффекторные или сочетание памяти и эффекторных клеток ответов. Долгосрочная культивируют IFN-γ ELISPOT анализа, описанные здесь, скорее всего, позволяет измерять ответов TCM, а не эффекторной Т-клетки или в сочетании CD4 + Т-клеточных ответов. Таким образом, долгосрочные культивируют IFN-γ ELISPOT анализ обеспечивает ценный подход для оценки Т-клеток памяти ответов и была с успехом использована для оценки реакции памяти нескольких видов на различных инфекций агентов 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Эффекторные и Т-клеток памяти создаются путем программирования развития наивных CD4 + Т-клеток после распознавания антигена. Дифференцировки наивных CD4 + Т-клеток в цитокинов клеток, продуцирующих требует признания патогена врожденных иммунных клеток, антигена Т-клеток, со-стимуляции и транскрипционные изменения в результате в поляризованном продукции цитокинов. Например: антиген-представляющих клеток продуцируют интерлейкин (IL) -12 в ответ на внутриклеточных патогенов, которые вместе с распознавание антигена, способствует дифференцировке Т-клеток в Т-хелперов 1 (Th1) клеток 1,2 с помощью передачи сигналов через преобразователь сигнала и активатор транскрипции 4 (STAT4) и Т-поле выражается в Т-клеток (Т-БЭТ), что приводит к активации клеток, IL-2, производства клональной экспансии и интерферона (ИФН) -γ производства 3,4. Если инфекция контролируется до 95% Т-клеток, полученных на стадии расширения исключаются (т.е. сужениефаза) и Т-клеток памяти остаются, иногда на всю жизнь 5. Sallusto др. 6, были выявлены два функционально различных подмножества Т-клеток памяти в организме человека на основе выражения лимфатических узлов самонаведения рецепторов. Центральные Т-клеток памяти (TCM) выражают CC хемокинов рецептор (CCR) -7 и CD45RO и расположены в основном в Т-клеточных зонах вторичных лимфоидных органов. Tcm ограничены эффекторной функции, низким порогом активации и сохраняют высокую интерлейкина-2 и пролиферативную способность. Эффектор Т-клеток памяти (ТЕА) выражают CD45RO, не хватает CCR7 и отображения рецепторы самонаведения периферийных или воспаленных тканей. Эффекторные клетки не экспрессируют либо CCR7 или CD45RO но оперативно производить эффекторные цитокины, такие как IFN-γ, при распознавании антигена. ИФН-γ релиз анализы (Игра) используются для диагностики крупного рогатого скота и человека туберкулезом 7. Mycobacterium Бови является основным агентом туберкулеза крупного рогатого скота (BTB), а человека окSES туберкулеза вызваны, главным образом, микобактерий туберкулеза. С помощью этих тестов, цельной крови или мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) стимулировали микобактериальных антигенов в течение 16 до 24 часов и производство IFN-γ в надосадочной жидкости измеряется ELISA или с помощью обнаружения клеток, продуцирующих IFN-γ с помощью ELISPOT техники. В результате краткого периода стимуляции (т.е.., От 16 до 24 ч) и быстрое производство цитокинов, исключая виво анализы обнаружить прежде эффекторные и ТЕА ответов. Это было подтверждено с помощью проточной цитометрии анализа клеточных популяций в этих культурах 8-10. Экс Vivo IFN-γ ответы обычно включены в оценки иммунного ответа панели вакцин туберкулеза, в том числе те, которые используются для оценки ответов от крупного рогатого скота. Наиболее эффективным крупного рогатого противотуберкулезные вакцины вызывают определенные IFN-γ ответов, но не все вакцины, которые индуцируют IFN-γ ответы защитная пре. Кроме того, уровни IFN-γ, вызванной вакцинацией, как измерено до заражения, не обязательно коррелируют с защитой. Например, различные штаммы БЦЖ может иметь различную мощность, чтобы вызвать экс виво IFN-γ ответ, несмотря на том же уровне защиты 11. Таким образом, экс естественных Играсом ценны для диагностики туберкулеза и для доступа к иммуногенности вакцины; Однако их использование в качестве предикторов эффективности вакцины ограничено. Tcm ответы на вакцинацию, с другой стороны, может быть использован для прогнозирования эффективности вакцины, как показано вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) инфекции в приматов 12,13, туберкулеза у мышей 14 и малярии у человека 15,16. После эффективного иммунного ответа, в результате чего зазор патогена, Tcm которые поддерживают и обеспечивают защиту к возможному второй инфекции тем же самым агентом. Заметным исключением этого сценария М. туберкулез инфеие людей, в которых пациенты, получающие лечебный анти-микобактерий терапии подвержены повторной инфекции 17,18. Кроме того, события, регулирующие иммунологическую память в течение хронических инфекций, в котором антигенной стимуляции сохраняется, не очень хорошо понял, 19. Во время хронических инфекций, таких как с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и туберкулеза, значительное ответ Tcm связано с благоприятным исходом (например, задержки с туберкулезом и субклинического заболевания с ВИЧ) 20,21. Несколько исследований на мышах и людях показали, что долгосрочные культурные IFN-γ ELISPOT анализы измерения TCM ответов 16,20-22. С этого анализа, РВМС культивировали в уменьшении концентрации антигена в течение 10 до 14 дней, что позволяет реакции эффекторных пик и уменьшаться; содействия Tcm дифференцировать и расширить в культуре. Долгосрочные культивированный IFN-γ ELISPOT анализы также были использованы в ветеринарииИсследование, пока фенотип отвечающих клеток было трудно оценить из-за отсутствия критических реагентов, особенно антитела к CCR7. Эффективные бычьи противотуберкулезные вакцины [например. используя одну дозу M. Бови Кальметта Герена (БЦЖ), БЦЖ следует вирусно-векторная антиген 85А субъединицы вакцины, или ослабляется М. Бови ΔRD1] вызвать долгосрочные культурные IFN-γ ELISPOT ответы после вакцинации, которые коррелируют с защитой (т.е. ниже микобактерий бремя и снижение ТБ-сопутствующая патология) против последующего заражения вирулентным M. Бови 23,24. Кроме того, число антиген-специфических IFN-γ-секретирующие клетки в долгосрочных РВМС культур выше на 12 месяцев, но уменьшить на 24 месяцев после вакцинации БЦЖ новорожденных телят, соотнося со степенью защиты обнаруживаемого сообщению М. Бови задача 25. В этом случае, культивируют IFN-γ ELISPOT являетсяп важным инструментом для прогнозирования эффективности вакцины, предоставляя средства для приоритизации вакцин-кандидатов для высокой стоимости испытаний эффективности. Кроме того, культивируемые методы ELISPOT может быть адаптирована для различных хостов, патогенов и цитокинов путем изменения антигены или антитела для различных целей в различных областях исследований.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sodium citrate (dihydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citric acid (monohydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dextrose</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT PVDF plate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC &#8211; AP KIT Standard</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>AK-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag85A</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0004.3</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB 10.4</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0061.6</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPDb</td>
			<td>Prionics AG</td>
			<td>7600055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rESAT-6:CFP10</td>
			<td>Kind gift Dr. Minion, Iastate</td>
			<td></td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783B</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Biotinylated Clone CC330</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2112</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1653GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2434GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-human CCR7 Clone 3D12</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947;-Pe Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7</td>
			<td>SouthernBiotechnology</td>
			<td>1080-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm&#8482;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrefeldinA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed Mitogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat human Interleukin 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle

Эффекторные и Т-клеток памяти создаются путем программирования развития наивных клеток после признания антигенов. Если инфекция контролируется до 95% Т-клеток, полученных на стадии расширения исключаются (т.е.., Фаза сжатия) и Т-клеток памяти остаются, иногда на всю жизнь. В организме человека, два функционально различных подмножества Т-клеток памяти были описаны на основе выражения лимфатических узлов наведения рецепторов. Центральный Т-клетки памяти выразить CC хемокинов рецептор 7 и CD45RO и расположены в основном в Т-клеточных зонах вторичных лимфоидных органов. Эффектор Т-клетки памяти выразить CD45RO, не хватает CCR7 и отображения рецепторы, связанные с наведением лимфоцитов периферических или воспаленных тканей. Эффекторные Т-клетки не выражают ни CCR7 или CD45RO но при встрече с антигеном производят эффекторных цитокинов, таких как интерферон-γ. Интерферон-γ высвобождением анализы используются для диагностики бычьего и человеческого туберкулеза иобнаружить в первую очередь эффектор эффектор и памяти Т-клеточные ответы. Клеточные ответы центральной памяти T CD4 + Т-клеток до вакцинации, а с другой стороны, может быть использован для прогнозирования эффективности вакцины, как показано вирусом иммунодефицита обезьян инфекции приматов, туберкулеза у мышей и малярии у человека. Несколько исследований на мышах и людях, а также неопубликованные данные о крупного рогатого скота, показали, что интерферон-γ ELISPOT анализы измерения центральной памяти Т-клеточные ответы. С этого анализа, мононуклеарных клеток периферической крови культивируют в уменьшении концентрации антигена для 10 до 14 дней (долгосрочная культура), что позволяет ответы эффекторные пик и уменьшаться; содействия центральных Т-клеток памяти, чтобы дифференцировать и расширить в культуре.

Примерно один месяц после аэрозольной инфекции M. Bovis (10 4 колониеобразующих единиц), от инфицированных РВМС (N = 8) и контрольные животные (N = 8) культивировали в присутствии антигенов и IL-2 в течение 13 дней. Развитие реакций TCM после заражения определяли с использованием IFN-γ ELISPOT анализа. Представитель Tcm (в присутствии или в отсутствии БТР) и экс естественных ИФН-γ ELISPOT ответы от инфицированных животных (трех животных) и неинфицированных животных (одно животное), показаны на рисунке 1. Успешного долгосрочного ИФН-γ ELISPOT результаты анализа в клетках, производящих IFN-γ (спот-клеток, образующих, SFC) при вынужденной условиях и почти полное отсутствие ответа от незараженных животных и под нестимулированных условиях. Кроме того, сильный Т-клеточный ответ должно происходить в ответ на PWM. Конкретные ответы на М. Bovis были оценены PPD-B или Решат-6: CFP10 антигенной стимуляции. Как показано на рисунке1, прочная КПП и экс VIVO ответы на PPD-B и Решат-6: CFP10 были обнаружены на всех трех М. Бови -infected животных. Минимальная чтобы не трлн.куб.м и бывших естественных условиях ответов были обнаружены с контрольным животным. Кроме того, присутствие АРС была необходима для оптимальных ответов TCM от инфицированных животных, как показали значительно сниженным ответов долгосрочными клеток, культивированных в отсутствие аутологичных АРС. Ответ ИФН-γ по МНПК от М. Бови инфицированных и неинфицированных животных представлены на рисунке 2. У каждого животного из ПФС номер рассчитывали как среднее число ПФС в одинаковых образцов в ответ на PPD-B минус соответствующего реагирования на одних СМИ. Ответы были оценены на 10 6 клеток. Ответы отличались (P &lt;0,05) на основе ВИЧ-статуса, наличия или отсутствия БТР и продолжительности культивирования (т.е.., Долгосрочные культура против экс естественных условиях культуры). <table border="0" cellpaddinг = &quot;0&quot; = CELLSPACING &quot;0&quot;&gt; <colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Приобретение образ пластин </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Включите машину </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Открыть &quot;Иммуно Захват&quot; Версия программного обеспечения 6.3. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Шаг 1: Выберите тип плиты. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Шаг 2: нагрузка пластины. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Шаг 3: выбрать параметры сканирования. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Шаг 4: начать сканирование. </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Получить общее изображение пластины. </td></tr><tr><td> 8. </td><td> Извлечь пластину. </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Закройте программное обеспечение «Иммуно Capture&quot;. </td></tr><tr><td colspan="2"> Подсчет пятна образующих единиц </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Откройте &quot;Иммуно пятна Capture&quot; версии 5.0. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Выберите объективистские<html> Тип T: нормально. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Выберите модуль подсчета: умный граф. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Шаг 1: нагрузка пластины. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Шаг 2: определить параметры подсчета: тест точность распознавания пятна на скважинах с различными пятнами. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Начните автоматический подсчет. </td></tr><tr><td colspan="2"> Контроль качества </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Открыть &quot;Immunospot Захват&quot; Версия программного обеспечения 5.0. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Выберите модуль подсчета: контроль качества. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Шаг 1: нагрузка пластины. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Шаг 2: Анализ Выделенные скважин индивидуально. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Завершите контроль качества. </td></tr></tbody></table> Таблица 1 - AutoImmun Диагностика ELISPOT приобретение читатель изображения и сотовый считая процедуру. ove_content &quot;FO: Keep-together.within-странице =&quot; всегда &quot;&gt; <img alt="Фигура 1" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig1.jpg" /> Рисунок 1. Изображение скважин с долгосрочной культурной ИФН γ ELISPOT анализа. Выращенный ИФН-γ ELISPOT анализ выполняли approximatelyone месяц после заражения вирулентным M. Бови (три животных). Незараженных животных были включены в качестве контрольных (одно животное) линии Долгосрочные клеток были получены путем стимулирования РВМС с коктейлем рекомбинантного Ag85A (1 мкг / мл), TB10.4 (1 мкг / мл), Решат-6.: CFP10 (1 мкг / мл) и PPD-B (5 мкг / мл) в течение 13 дней с последующим переходом на ELISPOT пластины в присутствии или в отсутствие аутологичной APC. Краткосрочные клетки состоял из РВМС, изолированных на 13 день и высевали непосредственно в ELISPOT пластины. Долгосрочные и краткосрочные клетки стимулировали PPD-B (10 мкг / мл), Решат-6: CFP10 (1 мкг / мл), одна средняя или лаконоса митоген (5 &amp;# 956; г / мл) в течение 24 ч. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig2.jpg" /> Рисунок 2. Типичные результаты долгосрочного культурного ИФН γ ELISPOT ответ на М. Бови очищенный белковый дериват (PPD-B). Искусственный ИФН-γELISPOT анализ проводили approximatelyone месяц после заражения вирулентным M. Бови (восемь животных). Незараженных животных были включены в качестве контрольных (восемь животных Долгосрочные клетки были получены путем стимулирования РВМС с коктейлем рекомбинантного Ag85A (1 мкг / мл), TB10.4 (1 мкг / мл), Решат-6: CFP10 (1 мкг / мл) и PPD-B (5 мкг / мл) в течение 13 дней с последующим переходом на ELISPOT планшеты в присутствии или в отсутствие аутологичных АРС. Краткосрочные клетки состоит из РВМС выделяли на 13-й день и высевали непосредственно в ELISPOT пластины . Долгосрочные и шоRT-термин клетки стимулировали PPD-B (10 мкг / мл) или только среды в течение 24 ч. Конкретные ответы от каждого животного (SFC / 10 6 клеток) представлены как ответ на PPD-B (в среднем дубликатов проб) минус ответ на только СМИ.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Long-term cultured Interferon-ÃŽÂ³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle at JoVE.com

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Долгосрочный культивируют интерферона-γ связанный с ферментом immunospot анализ используют в качестве меры центральных ответов памяти и коррелирует с защитных анти-микобактериальных ответов вакцин. С этого анализа, мононуклеарные клетки периферической крови стимулируют микобактериальных антигенов и интерлейкина-2 в течение 14 дней, что позволяет дифференциации и расширения центральных Т-клеток памяти.

Применение Долгосрочный культивируют Интерферон-γ фермент-связанного Immunospot анализе для оценки эффекторных и памяти T-клеточные ответы у крупного рогатого скота

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Фермент связанных Immunospot анализ (ELISPOT): Количественная оценка Th-1 клеточного иммунного ответа против микробных антигенов

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Использование интерферона-γ энзимных Анализ Immunospot для характеристики Роман Т-клеточных эпитопов вируса папилломы человека

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы<em&gt; В естественных условиях</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Индукционная мышиных воспаление кишечника с помощью приемных передачи эффекторных CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Высокая</sup&gt; Т-клеток в иммунодефицитных мышей

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Модель переходной трансгенерации IL-8 для<em&gt; В Виво</em&gt; Долгосрочный мониторинг воспалительных реакций

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Хроническая аутоиммунная модель сухих глаз с увеличением клеток памяти с эффекторной памятью в ткани глазного яблока

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Всасывания блистер протокол для изучения человеческий Т-клеточный вспомнить ответы в естественных условиях

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...