Name: methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Forfatterne takker Bill og Melinda Gates Foundation for sin støtte til teknologiudvikling og uddannelse.

Bemærk: Denne protokol omfatter mængder og koncentrationer for 96-brønds plade, 8-rør strimler og kapillære-baserede systemer (10 pi reaktionsvolumen); imidlertid kan HRM også udføres i 384-brønds plade-baserede systemer med et reaktionsvolumen på 5 pi ved at skalere alle mængder tilsvarende. Rækken af ​​detektion for de fleste systemer er 10 pg til 10 ng template-DNA. 1. Forbered Skabeloner <ol><li> Opnå Plasmodium falciparum prøver direkte fra blod fra patienter, der deltager i felten stedet og lagret som helblod, pelleterede røde blodlegemer eller på filtrerpapir. Bemærk: Prøver kan også være kultur-tilpasset til at vokse in vitro; nogle standard laboratoriestammer til analyse kan bestilles fra Malaria Research og reference Reagens Resource Center (MR4 kan Prøver anvendes direkte fra pelleterede røde blodlegemer eller kultur eller udvundet af fuldblod, røde blodlegemer, eller filterpapir. </li><li> DNA ekstraheret frafiltrerpapir eller kultur-tilpassede stammer Bemærk: HRM er følsom over for saltkoncentration; koncentrationsforskelle på grund af variable ekstraktionsmetoder kan have stor indflydelse smeltetemperaturer. Mens specifikke endelige buffere er ikke en væsentlig faktor for succes, bruge en standard fælles eluering eller resuspensionsbuffer (dvs. vand, 1x Te [&#39;lav Te &quot;eller&quot; DNA suspension buffer «: 10 mM Tris-CI, 0,10 mM EDTA] eller 1x TE [10 mM Tris-CI, 1 mM EDTA]) for alle prøver at undgå afvigende eller inkonsekvente melt kurver. <ol><li> Forbered skabelon fortyndinger af 10 pg -10 ng per pi i standard Te, TE eller vand for hver 10 pi reaktion. </li></ol></li><li> Direkte forstærkning fra pelleterede røde blodlegemer <ol><li> Bestem parasitæmi af røde blodlegemer under anvendelse af tynd-smear mikroskopi Bemærk: Metoder til bestemmelse parasitæmi af inficerede røde blodlegemer er tilgængelige fra Centers for Disease Control og Forebyggelse (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Fortynd parasitemias over 0,5% 1: 400 i PCR-grade vand, TE eller Te. Brug 3 pi for hver 5- 10 ul reaktion. </li></ol></li><li> Controls Bemærk: HRM kan anvendes til gen-scanning til at påvise sekvensvarianter i en population 12; Men præcis genotypning kræver standarder sekvens-verificerede at indeholde SNP blive afhørt. Plasmidkonstruktioner eller malaria isolater med kan anvendes kendte genotyper. Til de fleste anvendelser er 3D7 (MR4 MRA-151) anvendes som en vildtype kontrol. På grund af mellem-run variabilitet altid omfatte positive og negative kontroller. <ol><li> Positive kontroller: Forbered 10 pg - 10 ng pr 1 gl fortyndinger af plasmid eller standarder med sekvens-verificerede SNP genotyper. </li><li> Negativ kontrol: Brug PCR-kvalitet vand som en kontrol uden template (NTC) for amplifikationsreaktioner. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR-amplifikation <ol><li> Forbered reaktionsblandingen <ol><li> (Valgfrit) Mineralsk olie overlay. Bemærk: Nogle HRM systemer er enkeltstående smeltende platforme og ikke har en opvarmet låg for at forhindre kondensation og produktinformation fordampning under amplifikation. <ol><li> Tilsæt 20 gl let mineralolie til hver brønd plade før læsning reaktionsblandingen. </li></ol></li><li> Forbered 10x arbejder lagre af alle analyser <ol><li> Se Tabel 1 for anbefalede 10x arbejder lager koncentrationer samt endelige koncentrationer for blokeret-sonde-baserede HRM genotypebestemmelse. </li></ol></li><li> Forbered reaktionsblandinger <ol><li> Til hver brønd i pladen eller et rør, der tilsættes 1 ul 10 x arbejdslager forward og reverse primere og prober, 4.0 - 5.0 pi 2.5x eller 2.0x HRM Master mix, 1 pi skabelon og PCR-kvalitet vand til et samlet reaktionsvolumen på 10 pi . </li></ol></li><li> Dækplader eller rør <ol><li> Brug optisk plade seals til plade-baserede forstærkning, optiske hætter til strip-rør-baserede systemer, og plast hætter til kapillar-baserede systemer. Vær sikker dækning er komplet og plader og hætter er fuldstændig forseglet og sikret for at forhindre fordampning under opformering. </li></ol></li><li> Spin prøver <ol><li> Spin plader 3 minutter ved 1.800 xg for at fjerne luftbobler og for at adskille olie- og vandige faser, hvis der anvendes mineralolie. </li></ol></li></ol></li><li> Amplifikationsprotokollen <ol><li> Placer reaktionsbetingelser plader eller rør i termisk cycler. Kør standard blokeret-probe eller MAAB amplificeringsprotokoller (tabel 2 og 3, henholdsvis). Bemærk forskellen i annealing temperatur mellem disse metoder. </li></ol></li></ol> 3. HRM Analyse <ol><li> Smelte <ol><li> Efter PCR-amplifikation, gå videre til smeltning analyse. For enkeltstående smeltende systemer, der ikke har indbygget forstærkning (f.eks., BIOFIRE Defense LightScanner systemer), reflytte forstærket plade fra termiske cykler og plads i HRM instrument. Fra systemets software interface, smelte pladen 40-80 ° C for at fremstille både proben og amplicon smeltetoppe. Bemærk: For at spare smeltning og analyse tid, kan den smeltende vinduet afkortes til dækning temperaturområder for kun sonde eller regioner amplikon smeltende. Efter smeltning, plader og rør kan omsmeltes om nødvendigt og opbevaret ved -20 ° C eller 4 ° C. Store glasrør kun ved 4 ° C for at forhindre rør fra revner. </li></ol></li><li> Smelt analyse <ol><li> Fjern negative prøver <ol><li> Inden analysen software, fjernes fra yderligere analyse prøver, der ikke forstærker eller som har takkede smeltende toppe. Bemærk: Når du har valgt den form for analyse for en individuel løb fil, høreapparatet automatisk grupper de positive og negative prøver. Før genotype hver delmængde, kan brugeren manuelt ændre opkaldene. <ol><li> Fra enten smeltningenkurve eller smeltning peak visning, skal du højreklikke på kurverne, der skal fjernes for at vælge dem. Når du har valgt de forkert klassificerede prøver, gå til &quot;Nyt opkald,&quot; vælg den relevante gruppering, og klik på &quot;Apply Change&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Normalisere <ol><li> Fra den negative afledede af normaliserede fluorescens i forhold til temperatur (-dF / dT) (Forskel Curves &quot;) opfattelse, flytte normalisering barer at omgive sonden smelte regionen. Bemærk: Sonden smelte region er den lavere temperatur af de to smeltende regioner. Normaliseringsreferencerne stænger bør være i bunden af ​​smeltetopværdier. </li></ol></li><li> Beregn grupper <ol><li> Efter normalisering, at vælge &#39;Beregn grupper&#39; automatisk tildele prøver til grupper. Hvis det er nødvendigt, manuelt re-Tildel prøver til bestemte grupper. Bemærk: Nogle analyse software har sensitivitetstærsklerne høje som ikke kan ændres; i disse tilfælde software kunne tildele prøver til forskellige grupper, der visuelt hører til en anden. </li></ol></li><li> Tildel genotyper <ol><li> Tildel genotyper for hver gruppe er baseret på standarder (positive kontroller). <ol><li> Når brugeren bekræfter, at de beregnede grupper er korrekt (hvis ikke, der er foretaget, at korrekte ændringer under fanen Gruppering ved at vælge forkert klassificerede prøver og vælge den rigtige gruppe fra drop-box ved siden af ​​&quot;Nyt opkald&quot;), skal du vælge &quot;Rediger Group navne &quot;under&quot; Gruppering fanebladet &quot;. </li><li> Indtast genotyper standarderne i den tilsvarende farvede boks (for eksempel, hvis standard 3d7 har en kendt genotype A og er i den røde gruppe, den røde gruppe har genotypen A). Tryk &quot;OK&quot; og gemme resultaterne. </li></ol></li></ol></li><li> Eksport resultater <ol><li> Eksport genotype opkald som et regneark for yderligere prøve befolkning analyse. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Kontinuerlig HRM er en post-PCR-analyse trin; derfor prøve og assay setup ligner standard-PCR-protokoller, med den yderligere inkorporering af en fluorescerende indlejringsfarvestof bruges til at spore overgangen fra dobbeltstrenget til enkeltstrenget DNA under smelteprocessen trin høj opløsning. Den vigtigste faktor for en vellykket HRM analyse er et robust PCR-produkt. Assay design er nøglen, og flere værktøjer optimeret til HRM assay design er tilgængelige kommercielt og online 13. Amplicon længder på 80-150 basepar med tilhørende ~ 20 basepar blokeret prober centreret over SNP eller SNP&#39;er af interesse virker bedst at differentiere SNPs samt haplotyper af multiple SNPs inden sonden regionen. Prober kan blokeres ved hjælp af enten en 3&#39;C3 spacer eller et par mismatch 2 base ved 3&#39;-enden, som forhindrer forlængelse under amplifikation. Prober kan udformes til at passe til Watson Crick eller template-strengen; valgetafhænger af empirisk test for at afgøre, hvilken sonde design producerer acceptable smeltende toppe. Overskydende frem eller tilbage-primere anvendes til at fremstille enkeltstrenget amplifikationsprodukt, der annealer til de blokerede prober. Hvis proben indeholder den forreste streng sekvensen, derefter revers primer anvendes i overskud, typisk i en 1: 5-forhold, og vice versa for prober, der svarer til den omvendte streng. Tilsvarende HRM fungerer bedst med tilstrækkelig og robust PCR-produkt. PCR-reaktion optimering kræver gradient PCR og agarosegeler eller Bioanalyzer analyse for at bestemme optimale annealing temperaturer. Skabelon koncentration kan øges ved hjælp af metoder som præ-forstærkning, forudindtaget multiplex forstærkning af alle mål ved hjælp af lav primer koncentration og cyklus numre at øge skabelonen koncentrationen 13. Kun en håndfuld af instrumenter er kompatible med MAAB. De termiske egenskaber af glas kapillærer rør bruges in disse systemer lette denne fremgangsmåde. Den lille indvendige diameter af kapillærer samt hurtig varmeoverførsel gennem glas tilbyde strengere temperaturkontrol end standard-PCR plastvarer, som har langsommere overgangsfrekvenser mellem annealing og denatureringscykler grund af den termiske isolerende egenskaber af plast. Med denne fremgangsmåde kan afsløring følsomhed nedsættes fra 2-5% til mindre end 1% af en mutant allel i en blanding af vildtype og mutant alleler 10. HRM er en letkøbt, effektiv og økonomisk værktøj til SNP genotypning i en række forskellige indstillinger og mange applikationer, fra smitsomme sygdomme overvågningen til scanning for kræft genvarianter. Flere andre instrumenter, såsom Roche Nano og LightCycler systemer (480 og 96) samt Eco Real-time PCR-system tilbyde HRM i tillæg til standard forstærkning, real-time, og copy-nummer funktionalitet. Brug højere throughput maskiner koster HRM barcoding less end $ 0,50 per assay i vores hænder, herunder alle reagenser og forbrugsvarer. I forbindelse beskrevet her, felt-baserede applikationer tillader realtid befolkning overvågning af ændringer i forbindelse med malaria kontrolindsats, herunder befolkning mangfoldighed reduceret, afsløring af importerede parasit typer, og fremkomsten og spredningen af ​​SNPs forbundet med nedsat narkotika følsomhed. Justeringer af metoden tilbyder ekstra følsomhed nyttig til at informere fremskridt mod malaria eliminering og udryddelse.

Trods fornyet interesse for malaria bekæmpelse og udryddelse, malaria fortsat en verdensomspændende byrde, med næsten halvdelen af verdens befolkning i risiko for infektion og mere end 550.000 dødsfald årligt, især børn i Afrika syd for Sahara 1. Disse nye kontrol- og udryddelsesprogrammer er blevet støttet af den genomiske renæssance, med et stort antal malariaparasitter sekventeret og analyseret for mutationer forbundet med nedsat narkotika følsomhed, øget virulens, og til befolkningspolitik egenskaber 2,3. Single-nucleotid (SNP&#39;er) er blandt de mest almindeligt identificerede genetiske varianter 4-7. Bærbare SNP genotypebestemmelsesmetoder tilbyder on-site og real-time befolkning overvågning og sporing 8. Ud over fingeraftryk forskellige parasitter, er den &quot;molekylære stregkode&quot; også anvendes til at detektere dramatiske tidsmæssige forskydninger i allelfrekvenssamt variansen effektiv populationsstørrelse og kompleksitet infektion 9. Mens dette sæt af informative SNPs let tilpasses til mange genotype platforme, høj opløsning smeltning (HRM) analyse er især velegnet til felt-baserede undersøgelser, hvor følsomme og enkel betjening og påvisning af hidtil ukendte mutationer ved lave omkostninger i forhold til sekventering og andre tilgange er attraktive i ressourcefattige indstillinger. HRM starter med standard polymerasekædereaktion (PCR), der inkorporerer et fluorescerende farvestof. Post-PCR smelteanalyse bestemmer den maksimale amplicon smeltepunktet; en enkelt SNP forskel i en kort amplikon kan resultere i betydelige peak smeltetemperaturen (Tm) forskelle. Adskillige raffinementer til denne metode giver bedre genotypning beslutning til differentiere SNPs, herunder klasse IV (AT) SNPs, og afsløre mindre mutantalleler i prøver med flere alleler tilstedeværende (POLYGenomic infektioner). Først assayene optage korte prober centreret over SNP region foruden forward og reverse primere, som er til stede i forskellige koncentrationer. Disse blokerede prober er ikke amplificeret under PCR, men binder til den streng, der er produceret i overskud på grund af asymmetriske primerkoncentrationer der øger produktionen af ​​sonden-template produkt. Disse separate dobbeltstrengede amplikoner bestående af probe bundet til overskydende template-strengen er ~ 20-30 bp; deres faldt betydeligt længde sammenlignet med hele amplikon (80-150 bp) føre til meget større Tm forskelle forbundet med en enkelt eller flere baser probe-skabelon, stemmer ikke overens 10. For det andet, mutant allel forstærkning bias (MAAB) sænker reaktionen annealingstemperatur at forspænde reaktionen mod mutantalleler stede ved lave forhold i polygenomic infektioner. Annealingstemperatur indstilles mellem smeltepunkter på perfekt matchede (vildtype) og uoverensstemmende (mutant) probes. Ved denne temperatur bindingen af vildtype-allelen er stabil nok, at amplifikation hindres i forhold til sin mismatch tilsvarende, således påvirke forstærkningen mod mutante allel, når begge er til stede i en enkelt prøve 10. Med disse HRM raffinementer, har denne teknologi tillod sporing af oprindelsen og identiteten af parasitter, der er forbundet med epidemiske infektioner i Sydamerika 11 og detektion af nye mutationer, differentiering af flere SNPs placeret umiddelbart ved siden af hinanden i rækkefølge, og mutationer til stede i mindre end 1 % af allelerne i polygenomic prøver 10. Øget følsomhed er særlig vigtigt i områder, der nærmer pre-elimination status og de udsatte for nye lægemiddelresistens. Evnen til hurtigt og nemt identificere importerede parasitter og SNPs forbundet med nedsat følsomhed på stedet oplyser overvågning indsats og kontrolprogrammer omeffektiviteten af ​​deres implementeringer og identificerer hotspots for øget malaria udryddelse og elimination indsats. Denne protokol beskriver metoderne til blokeret-sonde-baserede og MAAB for øget HRM genotypning følsomhed.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Trods årtiers indsats for udryddelse, malaria er fortsat en global byrde. Seneste fornyet interesse for den regionale eliminering og global udryddelse har været ledsaget af øget genomisk information om Plasmodium parasit arter er ansvarlige for malaria, herunder karakteristika ved de geografiske populationer samt variationer forbundet med nedsat følsomhed over for malariamedicin. En almindelig genetisk variation, single-nukleotid polymorfier (SNP), tilbyder attraktive mål for parasit genotypebestemmelse. Disse markører er ikke kun nyttig til sporing lægemiddel-resistens markører, men også til sporing parasit populationer ved hjælp af markører der ikke hører under lægemiddel eller andre selektive pres. SNP genotypebestemmelsesmetoder tilbyder muligheden for at spore resistens samt fingeraftryk individuelle parasitter til befolkningen overvågning, især som reaktion på malaria kontrol indsats i regioner nærmer elimination status. Mens informative SNP&#39;er er blevet identificeret som er agnostiske til specifikke genotype teknologier, høj opløsning smeltning (HRM) analyse er særlig velegnet til felt-baserede undersøgelser. I forhold til standard fluorescerende-probe baserede metoder, der kræver individuelle SNP&#39;er i en enkelt mærket probe og tilbyde i bedste 10% sensitivitet til at opdage SNPs i prøver, der indeholder flere genomer (polygenomic), HRM tilbyder 2-5% følsomhed. Ændringer til HRM, såsom blokerede prober og asymmetriske primerkoncentrationer samt optimering af amplifikation annealeringstemperaturer at forspænde PCR mod amplifikation af den mindre allel, yderligere at øge følsomheden af ​​HRM. Mens følsomhed forbedring afhænger af den specifikke assay, har vi øget afsløring følsomhed til mindre end 1% af den mindre allel. I regioner nærmer malaria udryddelse, er afgørende for PR tidlig påvisning af nye eller importeret lægemiddelresistensOmpT respons. Ligeledes kan evnen til at opdage polygenomic infektioner og differentiere importerede parasit typer fra kryptiske lokale reservoirer informere kontrolprogrammer. Dette manuskript beskriver ændringer høj opløsning smeltende teknologi, der yderligere øger følsomheden for at identificere polygenomic infektioner i patientprøver.

Data kan visualiseres på flere forskellige måder, afhængigt af analyse software og instrument. Typisk en afbildning af den negative derivat af normaliseret fluorescens i forhold til temperatur (-dF / dT) mod temperatur resultater er mest ligetil for visualisering smeltetoppe og bestemme genotyper. En fuld smeltning vindue (40 ° C-80 ° C) vil resultere i både amplicon og sonde smeltende regioner. Figur 1 viser et eksempel på normaliserede smeltetoppe for begge regioner. Indstilling af analysevinduet til blot probeområdet resulterer i klar differentiering af toppe svarende til specifikke SNP&#39;er (figur 2). Probe-baseret analyse viser klart tilstedeværelsen af begge alleler som enkelte toppe med smeltetemperaturer, der svarer homozygote SNP toppe (figur 3). Figur 4 viser, progressiholdsvis reducere annealing temperatur under amplifikation (MAAB) resulterer i en skævhed i retning mutantallelen (venstre side peak) (figur 4A), hvilket resulterer i forøget følsomhed for mutante allel i en population af blandede alleler (Figur 4B). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figur 1. Probe og amplicon smeltende regioner. Plotte negative derivat af den normaliserede fluorescens med hensyn til temperatur over et bredt smeltning vindue resultater i både probe (lavere temperatur) og amplicon smeltetoppe, der kan analyseres. (Tilpasset fra Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Figur 2. Probe smeltetoppe. Perfekt kampe (typisk vildtype-alleler) resultere i højere smeltende toppe (rød), mens SNP paradoksproblemer har lavere smeltende temperaturer (grå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figur 3. Polygenomic smeltende toppe. Når begge alleller er til stede i en prøve, probe-baseret analyse HRM repræsenterer begge alleler som to-peak kurver (orange) med toppe, der svarer til single-allel prøver (rød og grå). (Tilpasset fra Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se et større v</a>ersion af dette tal. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figur 4. Mutant allel forstærkning bias (MAAB). A. Gradvis sænke forstærkningen annealingstemperatur forspænder smeltetoppen reaktionen mod top svarende til mutant (lavere temperatur) allel i en polygenomic eller polyallelic prøve. B. MAAB resulterer i HRM følsomhed til at detektere mindre alleler stede på mindre end 1% i polygenomic eller polyallelic prøver. (Del B tilpasset fra Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Tabel 1. Set-up af probebaserede høj opløsning smeltepunkt amplifikationsreaktioner. <table><tbody><tr><td> Komponent </td><td> Volumen pr rehandling (96-brønds plade og kapillarrør) </td><td> Volumen pr reaktion (384 brønde) </td><td> Slutkoncentration </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4-5 pi </td><td> 2-2,5 pi </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x overskydende primer </td><td> 1 pi </td><td> 0,5 pi </td><td> 0,50 uM </td></tr><tr><td> 10 x anden primer </td><td> 1 pi </td><td> 0,5 pi </td><td> 0,1 uM </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 pi </td><td> 0,5 pi </td><td> 0.40 uM </td></tr><tr><td> PCR-grade vand </td><td> 1-2 pi </td><td> 0,5-1 ul </td><td></td></tr><tr><td> Template-DNA </td><td> 1 pi </td><td> 0,5 pi </td><td> 0,01-10 ng / pl </td></tr><tr><td></td><td> 10 pi </td><td> 5 pi </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 2. Standard højopløselige smeltepunkt amplifikationsbetingelser. <table><tbody><tr><td> Temperatur </td><td> Tid </td></tr><tr><td> Holde </td><td> 95 ° C </td><td> 120 sek </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 cykler </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sek </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sek </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 cyklus </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sek </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sek </td></tr></tbody></table> * Denne temperatur er amplikon-afhængigt Tabel 3. Amplifikationsbetingelser for mutant allel forstærkning bias. <table><tbody><tr><td> Temperatur </td><td> Tid </td><td> Cykler </td><td> Rampe sats </td><td> Erhvervelse tilstand </td><td> Analyse tilstand </td></tr><tr><td> Denaturere </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sek </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Ingen </td&gt; <td> Ingen </td></tr><tr><td rowspan="2"> Cyklus </td><td> 95 ° C </td><td> 2 sek </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Ingen </td><td rowspan="2"> Kvantificering </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sek </td><td> 20 </td><td> Enkelt </td></tr><tr><td rowspan="3"> Smelte </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sek </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0,3 </td><td> Ingen </td><td> Ingen </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sek </td><td rowspan="2"> Kontinuerlig </td><td rowspan="2"> Smelte </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sek </td></tr></tbody></table> * Denne temperatur er amplikon-afhængige og vil blive reduceret, når du udfører MAAB

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Mens høj opløsning Smelteanalyse giver mulighed for at skelne mellem enkelte nukleotidpolymorfismer i en heterogen population, kan mutant allel forstærkning forspænding øge sin evne til at detektere alleler der er til stede ved relativt lave procentdele i en prøve. Denne protokol beskriver forbedringer, der forbedrer følsomheden af ​​høj opløsning smeltepunkt analyse.

Metoder til at øge følsomheden af ​​High Resolution Melting enkelt-nukleotid polymorfisme Genotypning i Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

To Metoder til heterokaryon Dannelse til Discover HCV Restriction Faktorer

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D og 3D kromosom maleri i malaria myg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimering af en High Throughput Setup til at studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion som model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Brug Overlay Assay til Kvalitativt foranstaltning Bakteriel Produktion af og følsomhed til Pneumokok Bakteriociner

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High Resolution Electron Microscopy af<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Type IV sekretionssystem Pili Produceret i varierende forhold Iron Tilgængelighed

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til måling immunresponser på malaria i forbindelse med hiv co-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder til at hæmme bakteriel Pyomelanin Produktion og Bestem den tilsvarende stigning i Følsomhed over for oxidativt stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

En hurtig metode til Blood Processing at øge udbyttet af Plasma-peptid niveauer i Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Metoder til at øge følsomheden af ​​High Resolution Melting enkelt-nukleotid polymorfisme Genotypning i Malaria

Metoder til at øge følsomheden af High Resolution Melting enkelt-nukleotid polymorfisme Genotypning i Malaria