Name: methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

De auteurs danken de Bill en Melinda Gates Foundation voor zijn ondersteuning van de technologie-ontwikkeling en training.

Opmerking: Dit protocol omvat volumes en concentraties van 96-wells plaat, 8-tube strips, en capillaire systemen (10 ui reactievolume); kan echter HRM ook worden uitgevoerd in 384-wells-plaat gebaseerde systemen met een 5 ul reactievolume door schaalvergroting alle volumes navenant. Het detectiebereik van de meeste systemen 10 pg tot 10 ng matrijs-DNA. 1. Bereid Templates <ol><li> Plasmodium falciparum verkrijgen monsters direct uit bloed verkregen van patiënten die deelnamen aan terreinsite studies en opgeslagen als volbloed, gepelleteerde rode bloedcellen of op filtreerpapier. Opmerking: De monsters kunnen ook kweek aangepast om te groeien in vitro; een aantal standaard laboratoriumstammen voor analyse kunnen uit de Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4 worden besteld, kunnen monsters direct gebruikt worden vanuit gepelleteerd rode bloedcellen of cultuur of geëxtraheerd uit volbloed, rode bloedcellen, of filterpapier. </li><li> DNA geëxtraheerd uitfilter papier of-cultuur aangepaste stammen Opmerking: HRM is gevoelig voor zoutconcentratie; concentratie verschillen als gevolg van variabele extractiemethoden kunnen aanzienlijke invloed hebben smelttemperaturen. Terwijl specifieke laatste buffers zijn niet een belangrijke factor voor succes, een standaard gemeenschappelijke elutie of resuspensie buffer (dat wil zeggen, water, 1x Te [&#39;low Te&#39; of &#39;DNA schorsing buffer&#39;: 10 mM Tris-Cl, 0,10 mM EDTA] of 1x TE [10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA]) voor alle monsters afwijkende of inconsistente smelt curven voorkomen. <ol><li> Bereid sjabloon verdunningen van 10 pg -10 ng per ul in standaard Te, TE of water voor elke 10 ul reactie. </li></ol></li><li> Directe versterking van gepelleteerde rode bloedcellen <ol><li> Bepaal parasitemie van rode bloedcellen met behulp van dunne-uitstrijkje microscopie Opmerking: Methoden voor het bepalen van parasitemie van geïnfecteerde rode bloedcellen zijn verkrijgbaar bij de Centers for Disease Control and Prevention (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Verdunnen parasitemias boven de 0,5% 1: 400 in PCR-kwaliteit water, TE, of Te. Gebruik 3 gl per 5- 10 pi reactie. </li></ol></li><li> Controles Opmerking: HRM kunnen worden gebruikt voor gentherapie scannen te detecteren sequentie varianten in een populatie 12; Maar accurate genotypering vereist normen sequentie geverifieerd aan de SNP bevatten ondervraagd. Plasmideconstructen of malaria isolaten met bekende genotypen worden gebruikt. Voor de meeste toepassingen 3D7 (MR4 MRA-151) wordt gebruikt als een wildtype controle. Vanwege tussen-run variabiliteit, altijd inclusief positieve en negatieve controles. <ol><li> Positieve controles: Bereid 10 pg - 10 ng per 1 pl verdunningen van plasmide of normen sequentie geverifieerd SNP genotypen. </li><li> Negatieve controle: Gebruik PCR kwaliteit water als een no-template controle (NTC) voor de amplificatie reacties. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR amplificatie <ol><li> Bereid reactiemengsel <ol><li> (Optioneel) Minerale olie overlay. Opmerking: Sommige HRM systemen zijn standalone smelten platforms en niet beschikt over een verwarmd deksel om condensatie en product verdamping tijdens amplificatie te voorkomen. <ol><li> Voeg 20 pl lichte minerale olie aan elke well plaat voordat het reactiemengsel. </li></ol></li><li> Bereid 10x werkvoorraden van alle assays <ol><li> Zie tabel 1 voor de aanbevolen 10x werkvoorraad concentraties evenals de definitieve concentraties voor geblokkeerde-probe-gebaseerde HRM genotypering. </li></ol></li><li> Bereid reactiemengsels <ol><li> Aan elk putje in de plaat of buis, voeg 1 pl 10x werkvoorraad voorwaartse en achterwaartse primers en probes, 4,0-5,0 ul 2.5x of 2.0x HRM master mix, 1 ui sjabloon en PCR-kwaliteit water voor een totale reactie volume van 10 pi . </li></ol></li><li> Afdekplaten of buizen <ol><li> Gebruik optische plaat seals voor plaat gebaseerde amplificatie, optische caps voor-strip-buis systemen en plastic doppen voor capillaire-gebaseerde systemen. Zorg dekking volledig en borden en kappen zijn volledig afgedicht en vastgezet om verdamping gedurende amplificatie voorkomen. </li></ol></li><li> Spin monsters <ol><li> Spin platen 3 min bij 1800 xg om luchtbellen te verwijderen en om de olie- en waterfasen te scheiden als minerale olie wordt gebruikt. </li></ol></li></ol></li><li> Amplificatieprotocol <ol><li> Plaats reactie platen of buizen in thermal cycler. Run standaard geblokkeerd-probe of Maab amplificatieprotocollen (tabellen 2 en 3, respectievelijk). Merk het verschil in hybridisatietemperatuur tussen deze methoden. </li></ol></li></ol> 3. HRM Analyse <ol><li> Smelten <ol><li> Na PCR-amplificatie, overgaan tot het smelten van de analyse. Voor standalone smelten systemen die niet beschikken over ingebouwde versterking (bv., Biofire Defensie LightScanner systemen), rebewegen versterkte plaat uit thermocycler en plaats in HRM instrument. Uit de systeemsoftware-interface, smelt de plaat boven 40 - 80 ° C voor zowel probe en amplicon smeltpieken produceren. Opmerking: Om het smelten en analyse tijd te besparen, kan het smelten venster worden ingekort tot temperatuurbereik dekken voor slechts peilen of amplicon smelten regio. Na smelten, platen en buizen kan opnieuw gesmolten eventueel en bewaard bij -20 ° C of 4 ° C. WINKEL glazen buizen Pas bij 4 ° C buizen kan breken. </li></ol></li><li> Smelt analyse <ol><li> Verwijdert negatieve monsters <ol><li> Binnen de analyse software, verwijderen uit nadere analyse monsters die niet versterken of die scherpe smeltpieken. Let op: Na het selecteren van de wijze van analyse voor een individuele run-bestand, het instrument automatisch groepen de positieve en negatieve monsters. Voordat genotypering elke subset kan de gebruiker handmatig de gesprekken wijzigen. <ol><li> Zowel voor het smeltencurve of smeltpiek bekijken, klik met de rechtermuisknop op de curves worden verwijderd om ze te selecteren. Na het selecteren van de onrechte monsters, ga naar &quot;Nieuw gesprek&quot;, selecteert u de juiste groep, en klik op &quot;Apply Change.&quot; </li></ol></li></ol></li><li> Normaliseren <ol><li> Van de negatieve afgeleide van genormaliseerde fluorescentie met betrekking tot de temperatuur (-dF / DT) (&#39;Difference Curves&#39;) bekijken, verplaatsen normalisering bars aan de sonde omringen smelten regio. Opmerking: De probe smelten regio is de lagere temperatuur van de beide smelten gebieden. De normalisatie staven moet aan de basis van de smelt pieken. </li></ol></li><li> Bereken groepen <ol><li> Na normalisatie, selecteer &#39;groepen Berekenen&#39; om automatisch monsters toe te wijzen aan groepen. Indien nodig, handmatig opnieuw toewijzen monsters op specifieke groepen. Opmerking: Sommige analyse software heeft een hoge gevoeligheid drempels die niet kunnen worden gewijzigd; in deze gevallen de software kunnen samples toewijzen aan verschillende groepen die visueel tot een andere. </li></ol></li><li> Genotypen toewijzen <ol><li> Genotypes toewijzen voor elke groep op basis van standaarden (positieve controles). <ol><li> Nadat de gebruiker bevestigt dat de berekende groepen correct zijn (zo niet, dat juist veranderingen zijn onder het tabblad Groepering door het selecteren onrechte monsters en de juiste groep te selecteren uit de drop-box naast &quot;Nieuw gesprek&quot; made), selecteer &quot;Edit Group Namen &quot;onder het tabblad&quot; Groepering &quot;. </li><li> Voer de genotypen van de standaarden in de overeenkomstige gekleurde box (bijvoorbeeld als standaard 3D7 een bekend genotype A en in de rode groep rood groep genotype A). Druk op &quot;OK&quot; en de resultaten opslaan. </li></ol></li></ol></li><li> Resultaten exporteren <ol><li> Export genotype noemt als een spreadsheet voor analyse verdere steekproef. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Continu HRM is een post-PCR analyse stap; Daarom monster en test opstelling is vergelijkbaar met standaard PCR-protocollen, met de extra opname van een fluorescerende intercalerende kleurstof gebruikt om de overgang van spoor dubbelstrengs enkelstrengs DNA in de hoge-resolutie smeltstap. De belangrijkste factor voor een succesvolle HRM-analyse is een robuust PCR product. Assay ontwerp is de sleutel, en verschillende tools geoptimaliseerd voor HRM-test design zijn commercieel en online 13 beschikbaar. Amplicon lengte van 80-150 baseparen met bijbehorende ~ 20 basenparen geblokkeerd sondes gecentreerd over de SNP of SNPs van belang het beste werken om SNPs alsmede haplotypes van meerdere SNPs differentiëren binnen de sonde regio. Probes kunnen worden geblokkeerd met behulp van een 3 &#39;C3 spacer of 2 basepaar misparing aan het 3&#39; uiteinde, welke verlenging gedurende amplificatie voorkomen. Probes kunnen worden ontworpen om de Watson Crick of matrijsstreng passen; de keuzeafhankelijk van empirische testen om te bepalen welke probe ontwerpacceptable smeltpieken produceert. Excess forward of reverse primers gebruikt enkelstrengs amplificatieproduct dat versmelt de geblokkeerde probes te produceren. Als de sonde zijn voorwaartse streng sequentie, dan reverse primer in overmaat wordt gebruikt, typisch in een 1: 5-verhouding, en vice-versa te probes die overeenkomen met de omgekeerde streng. Ook HRM werkt het beste met voldoende en robuuste PCR-product. PCR reactieoptimalisatie vereist gradiënt PCR en agarose gels of Bioanalyzer analyse optimale gloeitemperaturen bepalen. Templateconcentratie kan worden verhoogd onder toepassing van werkwijzen zoals pre-amplificatie voorgespannen multiplex amplificatie van alle doelen gebruikt lage primer concentratie en cyclus nummers om de templateconcentratie 13 verhogen. Slechts een handvol instrumenten zijn compatibel met Maab. De thermische eigenschappen van de glazen capillairen gebruikte buizen in betrokken systemen deze methode. De kleine inwendige diameter van de capillairen en de snelle warmteoverdracht door glas bieden strengere temperatuurregeling dan standaard PCR plasticware, die langzamere overgang weer tussen denaturatie en annealing cycli als gevolg van de thermische isolerende eigenschappen van de kunststof heeft. Met deze methode kan detectiegevoeligheden worden verlaagd van 2,5% tot minder dan 1% van een mutant allel in een mengsel van wild-type en mutante allelen 10. HRM is een gemakkelijke, efficiënte en economisch hulpmiddel voor SNP genotypering in een verscheidenheid van instellingen en tal van toepassingen, van infectieziekten surveillance om het scannen voor kanker gen-varianten. Verscheidene andere instrumenten, zoals de Roche Nano en LightCycler systeem (480 en 96) en het Eco real-time PCR systeem maken HRM naast standaardamplificatiemethoden, real-time en aantal kopieën functionaliteit. Met behulp van een hogere doorvoersnelheid machines, HRM barcoding kost less dan $ 0,50 per test in onze handen, met inbegrip van alle reagentia en verbruiksartikelen. In de hier beschreven context, field-based toepassingen kunt real-time bevolking surveillance voor veranderingen in verband met malaria controle-inspanningen, met inbegrip van verminderde diversiteit bevolking, detectie van geïmporteerde parasiet soorten, en het uiterlijk en de verspreiding van SNPs geassocieerd met een verminderde gevoeligheid drug. Verfijningen aan de methode bieden extra gevoeligheid nuttig voor de ontwikkeling van malaria eliminatie en uitroeiing informeren.

Ondanks de hernieuwde belangstelling voor malaria bestrijding en uitroeiing, malaria blijft een wereldwijde belasting, met bijna de helft van de wereldbevolking risico op infectie en meer dan 550.000 doden per jaar, met name kinderen in sub-Sahara Afrika 1. Deze nieuwe bestrijding en uitroeiing programma&#39;s zijn ondersteund door de genomische renaissance, met grote aantallen malariaparasieten gesequenced en geanalyseerd voor mutaties geassocieerd met een verminderde gevoeligheid voor drugs, verhoogde virulentie, en voor de kenmerken bevolking 2,3. Single nucleotide polymorfismen (SNP&#39;s) behoren tot de meest geïdentificeerde genetische varianten 4-7. Draagbare SNP genotypering methoden bieden op het terrein en real-time bewaking bevolking en het bijhouden 8. Naast vingerafdrukken individuele parasieten, is de moleculaire streepjescode ook dramatische tijdelijke verschuivingen in allelfrequentie detecterenevenals variantie effectieve populatiegrootte en de complexiteit van de infectie 9. Hoewel deze reeks informatieve SNP&#39;s is eenvoudig aan te passen aan vele genotypering platforms, hoge resolutie smelten (HRM) analyse is bijzonder geschikt om het veld op basis van studies, waar gevoelige en eenvoudige bediening en detectie van nieuwe mutaties tegen lage kosten in vergelijking met sequencing en andere benaderingen zijn aantrekkelijk in resource-arme instellingen. HRM begint met standaard polymerase-kettingreactie (PCR), die een fluorescerende kleurstof bevat. Post-PCR smelten analyse bepaalt de piek amplicon smelttemperatuur; één SNP verschil in een korte amplicon kan aanzienlijke piek smelttemperatuur (Tm) verschillen. Diverse verfijningen van deze methode bieden betere genotypering resolutie te SNPs waaronder klasse IV (AT) SNPs differentiëren en detecteren kleine mutante allelen in monsters met meerdere allelen aanwezig (polygenomic infecties). Ten eerste, de assays omvatten korte probes gecentreerd over het gebied SNP naast voorwaartse en reverse primers die aanwezig zijn op verschillende concentraties. Deze geblokkeerde probes worden niet geamplificeerd in PCR, maar bindt aan de streng die boven vanwege asymmetrische primerconcentraties dat de productie van de probe-template product te verhogen. Deze afzonderlijke dubbelstrengs amplicons bestaande uit sonde gebonden aan de overtollige matrijsstreng zijn ~ 20-30 bp; hun lengte significant af vergeleken met de totale amplicon (80-150 bp) leiden tot veel grotere Tm verschillen met enkelvoudige of meervoudige base probe-template komt niet overeen 10. Tweede, mutant allel versterking vooringenomenheid (Maab) verlaagt de reactie gloeitemperatuur om vertekening van de reactie in de richting van mutante allelen aanwezig bij lage verhoudingen in polygenomic infecties. De annealing temperatuur ligt tussen de Tms van perfect op elkaar afgestemd (wild-type) en mismatched (mutant) probes. Bij deze temperatuur, de binding van de wild-type allel is stabiel genoeg dat amplificatie wordt belemmerd ten opzichte van zijn mismatch equivalent, waardoor voorspannen van het amplificatie richting mutant allel wanneer beide aanwezig zijn in een enkel monster 10 zijn. Met deze HRM verfijningen is deze technologie volgen van oorsprong en identiteit van parasieten geassocieerd epidemische infecties in Zuid-Amerika 11 en detectie van nieuwe mutaties differentiatie van verschillende SNPs zich direct naast elkaar in de juiste volgorde, en mutaties die aanwezig kunnen zijn op minder dan 1 % van de allelen in polygenomic 10 monsters. Verhoogde gevoeligheid is vooral belangrijk in gebieden benaderen pre-eliminatie toestand en risicogroepen opkomende resistentie. De mogelijkheid om snel en eenvoudig ingevoerd parasieten en SNPs geassocieerd met verminderde gevoeligheid eigen identificatie informeert surveillance inspanningen en controleprogramma&#39;s overde effectiviteit van hun implementaties en identificeert hotspots voor verhoogde malaria uitroeiing en eliminatie inspanningen. Dit protocol beschrijft de methoden voor geblokkeerde-probe-gebaseerde en Maab voor verhoogde HRM genotypering gevoeligheid.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Ondanks decennia van uitroeiing inspanningen, malaria blijft een wereldwijde belasting. Recente hernieuwde belangstelling voor regionale eliminatie en wereldwijde uitbanning ging gepaard met verhoogde genomische informatie over de parasiet Plasmodium soorten die verantwoordelijk is voor malaria, met inbegrip van de kenmerken van de geografische populatie evenals variaties geassocieerd met een verminderde gevoeligheid voor medicijnen tegen malaria. Een veel voorkomende genetische variatie, single-nucleotide polymorfismen (SNP&#39;s), biedt een aantrekkelijk doelwit voor parasiet genotypering. Deze markers zijn nuttig niet alleen voor het bijhouden drugresistentie markers maar ook voor het volgen parasietenpopulaties behulp markers niet onder geneesmiddel of ander selectiedruk. SNP genotypering methoden bieden de mogelijkheid om geneesmiddelresistentie te sporen en aan individuele parasieten vingerafdruk voor bewaking bevolking, met name in reactie op malariacontrole inspanningen in gebieden bijna elimination staat. Terwijl informatieve SNPs geïdentificeerd die agnostische specifieke genotypering technologieën met hoge resolutie samensmelten (HRM) analyse is bijzonder geschikt voor veld-gebaseerde studies. In vergelijking met standaard fluorescentie-probe gebaseerde methoden die individuele SNPs in één gelabelde probe nodig en bieden hoogstens 10% gevoeligheid voor SNPs te detecteren in monsters die meerdere genoom (polygenomic) bevatten, HRM biedt 2-5% sensitiviteit. Wijzigingen aan HRM, zoals geblokkeerde probes en asymmetrische primerconcentraties en optimalisatie van de amplificatie annealing temperaturen voorspanning aan PCR amplificatie van het kleinere allel, verder de gevoeligheid van HRM. Terwijl de verbetering gevoeligheid is afhankelijk van de specifieke test hebben we detectiegevoeligheden steeg tot minder dan 1% van het kleinere allel. In regio&#39;s naderen malaria uitroeiing, vroegtijdige opsporing van nieuwe of geïmporteerde resistentie tegen geneesmiddelen is essentieel voor de prOmpT reactie. Op dezelfde manier kan de mogelijkheid om polygenomic infecties te detecteren en te differentiëren geïmporteerde parasiet soorten van cryptische lokale reservoirs controleprogramma&#39;s op de hoogte. Dit manuscript beschrijft wijzigingen in hoge resolutie smelten technologie verder te verhogen de gevoeligheid voor polygenomic infecties bij patiënten monsters te identificeren.

Gegevens kunnen worden gevisualiseerd op verschillende manieren, afhankelijk van de analysesoftware en instrument. Typisch, een plot van de negatieve afgeleide van genormaliseerde fluorescentie met betrekking tot de temperatuur (-dF / dT) tegen temperatuur resultaat is eenvoudigste voor het visualiseren smeltpieken en het bepalen van genotypen. Een volledige smelt venster (40 ° C-80 ° C) leiden tot zowel amplicon en probe smelten gebieden. Figuur 1 toont een voorbeeld van genormaliseerde smeltpieken beide gebieden. Het analysevenster instellen om alleen het probegebied resultaten in duidelijke differentiatie van pieken die overeenkomen met specifieke SNPs (figuur 2). Probe-gebaseerde analyse toont duidelijk de aanwezigheid van beide allelen als individuele pieken bij een smelttemperatuur die overeenkomen homozygoot SNP pieken (figuur 3). Figuur 4 toont dat Progressively de annealing temperatuur tijdens amplificatie (Maab) resulteert in een vermindering voorkeur voor het mutante allel (linkszijdige peak) (Figuur 4A), wat resulteert in verhoogde gevoeligheid voor het mutante allel in een populatie van gemengde allelen (Figuur 4B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figuur 1. Probe en amplicon smelten gebieden. Opstellen van de negatieve afgeleide van de genormaliseerde fluorescentie met betrekking tot de temperatuur over een breed smelt resultatenvenster zowel probe (lage temperatuur) en amplicon smeltpieken die kunnen worden geanalyseerd. (Aangepast van Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 2. Probe smeltpieken. Perfect wedstrijden (meestal wild-type allelen) leiden tot hogere smeltpieken (rood), terwijl de SNP mismatches hebben lagere smelttemperatuur (grijs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figuur 3. Polygenomic smeltpieken. Wanneer beide allelen in een monster aanwezig zijn, probes gebaseerde HRM analyse vertegenwoordigt zowel allelen twee-piek curves (oranje) met pieken die overeenkomen met één allel samples (rood en grijs). (Aangepast van Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere v bekijken</a>ersie van dit cijfer. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figuur 4. Mutant allel amplificatie vertekening (Maab). A. Geleidelijk verlagen van de versterking gloeitemperatuur biases de smeltpiek reactie op de piek die overeenkomt met de mutant (lagere temperatuur) allel in een polygenomic of polyallelic monster. B. Maab resulteert in HRM gevoeligheid voor kleine allelen aanwezig bij minder dan 1% in polygenomic of polyallelic monsters te detecteren. (Deel B aangepast van Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Tabel 1. Set-up van-probe gebaseerde hoge resolutie smelten amplificatiereacties. <table><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume per reActie (96-well plaat en capillaire buis) </td><td> Volume per reactie (384-wells plaat) </td><td> Eindconcentratie </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4-5 pi </td><td> 2-2,5 pi </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x Excess primer </td><td> 1 gl </td><td> 0,5 pl </td><td> 0,50 uM </td></tr><tr><td> 10 x Andere primer </td><td> 1 gl </td><td> 0.5μl </td><td> 0,1 uM </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 gl </td><td> 0,5 pl </td><td> 0,40 uM </td></tr><tr><td> PCR-kwaliteit water </td><td> 1-2 pi </td><td> 0,5-1 pi </td><td></td></tr><tr><td> Template DNA </td><td> 1 gl </td><td> 0,5 pl </td><td> 0,01-10 ng / ul </td></tr><tr><td></td><td> 10 gl </td><td> 5 gl </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 2. Standard hoge resolutie smelten versterking voorwaarden. <table><tbody><tr><td> Temperatuur </td><td> Tijd </td></tr><tr><td> Greep </td><td> 95 ° C </td><td> 120 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 cycli </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 cycle </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sec </td></tr></tbody></table> * Deze temperatuur is afhankelijk amplicon Tabel 3. Amplificatieomstandigheden mutante allel amplificatie vertekening. <table><tbody><tr><td> Temperatuur </td><td> Tijd </td><td> Cycli </td><td> Ramp rate </td><td> Acquisitie modus </td><td> Analyse-modus </td></tr><tr><td> Denatureren </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Geen </td&gt; <td> Geen </td></tr><tr><td rowspan="2"> Cyclus </td><td> 95 ° C </td><td> 2 sec </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Geen </td><td rowspan="2"> Kwantificatie </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sec </td><td> 20 </td><td> Single </td></tr><tr><td rowspan="3"> Smelten </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sec </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> Geen </td><td> Geen </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sec </td><td rowspan="2"> Ononderbroken </td><td rowspan="2"> Smelten </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sec </td></tr></tbody></table> * Deze temperatuur amplicon-afhankelijk en neemt af als het uitvoeren Maab

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Terwijl hoge resolutie smeltende analyse biedt de mogelijkheid om te differentiëren tussen single nucleotide polymorfismen in een heterogene populatie, kunnen mutante allel amplificatie vertekening zijn vermogen allelen aanwezig betrekkelijk lage percentages in een monster te detecteren verhogen. Dit protocol beschrijft verbeteringen die de gevoeligheid van hoge resolutie smeltende analyse te verbeteren.

Methoden om de gevoeligheid van hoge resolutie Melting Single Nucleotide Polymorphism genotypering in Malaria Verhoog

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Er zijn twee methoden van Heterokaryon vorming van HCV Beperking Factoren Ontdek

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Met behulp van de overlay test om Kwalitatief Meet Bacteriële productie van en gevoeligheid voor pneumokokken Bacteriocines

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Hoge Resolutie Elektronenmicroscopie van de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Type IV Afscheiding System Pili Geproduceerd in wisselende omstandigheden van Iron Beschikbaarheid

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model voor het meten van immuunrespons op Malaria in de context van HIV Co-infectie

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Methoden te remmen Bacteriële Pyomelanin Productie en Bepaal de overeenkomstige stijging van de gevoeligheid voor oxidatieve stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Een snelle methode voor bloedverwerkende de opbrengst aan plasma peptide niveaus in bloed verhogen

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...